實驗二蛋白質(zhì)等電點及含量測定.ppt

1,實驗二 蛋白質(zhì)等電點及含量測定,1臺可見光分光光度計配套4個玻璃比色杯，用完務必立即洗凈、晾干。切忌用試管刷或粗糙布(紙)擦拭。 實驗結束后，務必將使用過的玻璃器皿洗凈、晾干、放回原處。,【溫馨提示】,P40/P51,2,學習蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，掌握pH值法測定蛋白質(zhì)等電點的一般原理和操作方法。 學習和掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度的原理和操作方法。,【實驗目的】,01,蛋白質(zhì)等電點的測定,4,【實驗原理】pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：,5,蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點（pI）。在等電點時，蛋白質(zhì)分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。 牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7-4.8。本實驗采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點值。,【實驗原理】pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點,6,實驗儀器 4支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）等。 實驗材料和試劑 蒸餾水、1M醋酸、0.1M醋酸、0.01M醋酸、酪蛋白溶液。,【儀器試劑耗材】 pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點,7,【操作步驟】pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點,每小組取4支15mL玻璃試管，按下表順序分別精確地加入各試劑，加入后立即混勻，加一管，搖勻一管。,靜置，觀察各管在不同時間的混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電點。觀察時可用+，+，+，表示渾濁度。,8,【實驗結果與分析】 pH值沉淀法測定蛋白質(zhì)等電點,觀察各管中清澈度變化，記錄結果（ 用+，+，+，表示渾濁度）并解釋現(xiàn)象。 確定酪蛋白的等電點。,蛋白質(zhì)在等電點沉淀的原因是什么？影響該實驗結果準確性的因素有哪些？,【思考題】,02,蛋白質(zhì)含量的測定,雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,11,【實驗原理】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩分子尿素經(jīng)180左右加熱，放出1個分子氨后得到的產(chǎn)物。 在強堿性溶液中，雙縮脲能與Cu 形成紫紅色絡合物，稱為雙縮脲反應。 凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過1個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反應。,2+,12,【實驗原理】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,紫紅色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關，顏色深淺可在540 nm比色測定，故可用此法來測定蛋白質(zhì)含量。測定的蛋白質(zhì)濃度范圍為1-10 mg/mL。 此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。,13,實驗儀器 6支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）、可見光分光光度計等。（繪制標準曲線） 2支15mL玻璃試管、移液管、吸耳球、移液槍（200uL）、槍頭（200uL）、可見光分光光度計等。（樣品測定） 實驗材料和試劑 雙縮脲試劑、標準牛血清蛋白、蒸餾水、待測樣品（可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白）。,【儀器試劑耗材】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,14,【操作步驟】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,1.標準曲線的繪制。（全班繪制1份即可） 取6支15mL試管，編號0-5，按下表順序加入各試劑。,15,【操作步驟】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,上述試劑加完后，充分混勻，室溫放置30 min。 以0號管為對照管，于540 nm處比色測定吸光值，記下各管吸光度。 以每管蛋白質(zhì)含量為橫坐標，對應吸光度為縱坐標，作吸光度-蛋白質(zhì)含量標準曲線。（見電腦桌面Excel表格“標準曲線繪制”）,16,【操作步驟】雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,2.蛋白質(zhì)樣品測定 （每小組做1份） 1.另取2支試管，分別加1 mL未知濃度的酪蛋白蛋白質(zhì)樣品液（注意樣品濃度不要超過10 mg/mL），加1 mL蒸餾水，加4 mL雙縮脲試劑，混勻，室溫放置30 min。 2.2支樣品溶液于540nm處比色測定吸光值。 3. 取兩組樣品測定的吸光值平均值，根據(jù)回歸方程計算出相應蛋白質(zhì)的 濃度。 4.按下列公式計算出樣品蛋白質(zhì)的含量：,樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100 mL）=YN100/V,式中，Y為標準曲線查得的蛋白質(zhì)的量（mg），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積（mL）。,y = 0.042x - 0.0004,17,【實驗結果與分析】 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量,樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100 mL）=YN100/V,2.計算樣品蛋白質(zhì)的含量,式中，Y為標準曲線查得的蛋白質(zhì)的量（mg），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品所取的體積（mL）。,1.繪制蛋白質(zhì)標準曲線,18,【思考題】,影響標準曲線的因素有哪些？,蛋白質(zhì)含量測定中需要注意什么問題？,19,【注意事項】,等電點測定的實驗要求各種試劑的濃度和加入量必須非常準確。 標準曲線選擇不能只看R ，還應該看曲線斜率和截距。R 大小與實驗操作和儀器都有關系。 顯色時間過