生化工程第五章微生物培養(yǎng)及發(fā)酵動力學.ppt

第五章 微生物培養(yǎng)及發(fā)酵動力學,內容,1 基本概念 2 微生物反應的物料衡算 3 微生物反應的能量衡算 4 微生物反應動力學,微生物生長的基質,微生物反應的特點,二 微生物反應過程的質量衡算,例題：(選自賈士儒4869頁) 1.葡萄糖為基質進行面包酵母（S.cereviseae）培養(yǎng)，培養(yǎng)的反應式可用下式表達，求計量關系中的系數(shù)a、b、c、d。 反應式為： C6H12O63O2aNH3 bC6H10 NO3(面包酵母)cH2OdCO2,解：據(jù)平衡方程式,可得： C: 6=6b+d H: 12+3a=10b+2c O: 6+6=3b+c+2d N: a=b 方程聯(lián)立求解為：a=b0.48 c=4.32 d=3.12 上述反應計量關系式為: C6H12O63O20.48NH3 0.48C6H10NO34.32H2O 3.12CO2,練習 1葡萄糖為碳源，NH3為氮源進行釀酒酵母發(fā)酵。呼吸商1.04。消耗100mol葡萄糖和48mol NH3生產了48 mol菌體、312 mol CO2和432molH2O。求氧的消耗量和酵母菌體的化學組成。（呼吸商RQCO2 生成速率/O2消耗速率）,第二節(jié) 微生物反應過程的得率系數(shù) 研究得率系數(shù)的意義： 對碳源等物質生成細胞或其他產物的潛力進行定量評價的重要參數(shù)。 分為以下幾類：,部分菌體得率與產物得率 得率 定義單位 YX/S消耗1g或1mol基質獲得的干菌體克數(shù)，g/g, g/mol YATP消耗1molATP獲得的干菌體克數(shù)，g/mol YKJ消耗1KJ熱量獲得的干菌體克數(shù)， g/KJ YX/O消耗1gO2獲得的干菌體克數(shù)，g/g YX/H 1mol氫受體產生的干菌體克數(shù)，g/mol YX/N 消耗1g氮產生的干菌體克數(shù)，g/mol YX/NO3-消耗1mol NO3獲得的干菌體克數(shù)，g/mol YCO2/S消耗1mol基質產生的CO2的摩爾數(shù)，mol /mol YCO2/O消耗1mol O2產生的CO2的摩爾數(shù)，mol /mol YATP/S消耗1mol基質獲得的ATP的摩爾數(shù)，mol /mol Yave-消耗1個有效電子獲得的干菌體克數(shù)，g/ave,細胞得率（生長得率）: YX/S生產細胞的質量g / 消耗基質的質量g X/（-S） 碳元素的細胞得率: YC 細胞生產量細胞含碳量/基質消耗量 基質含碳量 YX/S(Xc/Sc),1葡萄糖為碳源，NH3為氮源進行某細菌的好氧培養(yǎng)。消耗的葡萄糖有2/3的碳源轉化為細胞中的碳。反應式為： C6H12O6aO2bNH3 c(C4.4OH7.3N0.86O1. 2)dH2O eCO2 計算上述反應中的得率系數(shù)YX/S 和YX/O 解：據(jù)平衡方程式,可得： C: 6=4.4ce H: 12+3b=7.3c+2d O: 6+2a=2.2c+d +2e N: b=0.86c 由于1mol葡萄糖中含碳72g, 轉化為細胞內的碳為722/3=48(g) 故：（4.412）c=48 得： c= 0.91,轉化為CO2的碳為724824（g） 故： 12e=24 e=2 解平衡方程中其他未知數(shù)，得： b=0.78; d=3.85; a=1.47 故平衡方程為： C6H12O61.47O20.78NH3 0.91(C4.4OH7.3N0.86O1.2)3.85H2O2CO2 YX/S0.91（124.4167.3140.86161.2）/ 1800.46(g/g)(以細胞/葡萄糖計) YX/O83.1/（1.4732）1.77(g/g)(以細胞/氧計),第三節(jié) 微生物反應過程的能量衡算 微生物反應是放熱過程。 微生物利用碳源，通過呼吸（有氧）或發(fā)酵（無氧）將能量轉化為ATP，供微生物生長、代謝，其余能量作為熱量排出，進行微生物優(yōu)化培養(yǎng)時，必須進行適宜的溫度控制。 從反應熱的角度考慮反應過程中的能量代謝，進行能量衡算。,一 菌體得率 1YKJ ：微生物對能量的利用(消耗1KJ熱量獲得的干菌體克數(shù)， g/KJ) YKJ X (細胞生產量) Ea(細胞貯存自由能)+Eb(分解代謝釋放自由能) (-Ha)(X)+(-Hc) Ha :菌體X的燃燒熱為基準的焓變，因菌體不同，一般 取值Ha22.15kJ/g Hc :所消耗基質的焓變與代謝產物焓變之差， Hc (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) (-H0*)(-O2) Hs :碳源氧化的焓變，kJ/mol； Hp :產物氧化的焓變，kJ/mol； H0*:為呼吸反應焓變444 kJ/mol-O2,故總表達式可寫為： YKJ X (-Ha)(X)+ (-Hs)(-S)- (-Hp)( P) Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s,干酪乳桿菌在蛋白胨、牛肉膏為主要成分的復合培養(yǎng)基 中，分別以葡萄糖、甘露醇為能源進行培養(yǎng)，計算YKJ 由化工手冊查知： H葡萄糖2816 kJ/mol，H乙酸870 kJ/mol， H乙醇1368 kJ/mol， H甲醇264 kJ/mol，H乳酸1363 kJ/mol， H甘露醇3038 kJ/mol， Ha22.15 kJ/mol,解：以葡萄糖為能源時， YKJ Yx/s (-Ha) Yx/s + (-Hs) - (-Hp) Yp/s 其中: (-Hp) Yp/s13630.05 8701.05 13680.94 2641.76 2732（kJ/mol） YKJ 62.0 22.1562.0 + 2816 - 2732 0.043 （g/kJ） 以甘露醇為能源時, (-Hp) Yp/s13630.4 8700.22 13681.29 2641.6 2925（kJ/mol） YKJ 40.5 22.1540.5 + 3038 - 2925 0.041 （g/kJ）,2 反應熱（代謝熱或發(fā)酵熱） Hh 基質燃燒熱菌體燃燒熱產物燃燒熱 = HsS- HxX -HpP 例題： 葡萄糖為惟一碳源進行酵母培養(yǎng)。反應式為： 1.11C6H12O62.10O2 C.3. 92 H6. 5O 1. 943.42H2O 2.75CO2 求（1）Yx/s; (2) 生成1kg細胞量時的Hh。已知酵母細胞和葡萄糖的燃燒熱分別為1.50104kJ/kg和1.59104kJ/kg。,解： Yx/s酵母細胞分子質量/1.11葡萄糖分子質量 3.92126.51.9416 / 1.11180 84.58/199.8 0.42（kg/kg） 生成1kg酵母細胞需要葡萄糖1/0.42=2.38(kg) Hh HsS- HxX 1.591042.381.501041 2.25104（kJ）,2.分別采用含有蛋白胨和牛肉膏的復合培養(yǎng)基、含有多種氨基酸合成培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基進行單胞菌的厭氧培養(yǎng)。碳源為葡萄糖，獲得如下結果(下表)。已知菌體的含碳量（以碳源/細胞計）為0.45g/g ,求采用不同培養(yǎng)基時的YkJ. 化工手冊可知H葡萄糖2816kJ/mol, H乙醇1368kJ/mol, H乳酸1363kJ/mol, Ha22.15kJ/mol.,一 發(fā)酵動力學研究內容： 研究細胞生長速度與產物生成速 度的關系及環(huán)境條件對速度的影響。 二 發(fā)酵過程的反應描述：,X S（底物） X（菌體） P（產物）,發(fā)酵反應動力學的研究內容,研究反應速度及其影響因素并建立反應速度與影響因素的關聯(lián),反應動力學模型,反應器特性,+,反應器的操作模型,操作條件與反應結果的關系，定量地在線控制反應過程,調整期,對數(shù)期,穩(wěn)定期,衰亡期,二 微生物生長曲線,第一節(jié) 微生物生長動力學的基本概念,一、微生物在一個密閉系統(tǒng)中的生長情況：,時間,菌體濃度,延遲期,指數(shù)生長期,減速期,靜止期,衰亡期,延遲期：,指數(shù)生長期:,倍增時間：td,靜止期： ;,衰亡期:,一 指數(shù)生長方程 dX/dt = （ ）X X為微生物的菌體濃度，單位體積內干細胞質量（g/L）； 比生長速率，每單位細胞濃度的生長速率(1/min;1/h)； 為細胞自溶或內源代謝速率，其導致細胞量的損失. 在 指數(shù)生長期，,故上式可改寫為： dX/dt = X， 積分變形為： ln (X/X0) =t 或 t = ln (X/X0) / 或 X=X0 et,第二節(jié) 微生物生長動力學,注： 1）一般情況下，在微生物生長的各階段，細胞增值規(guī)律均符合指數(shù)生長定律，但值隨時間變化； 2）在指數(shù)生長期，值達最大m ，且保持穩(wěn)定；其他生長期， 值隨時間變化。 3）表示微生物生長快慢的另一方法： 倍增時間td：菌體細胞質量增加一倍所需的時間 td =0.693/,例： 以乙醇為碳源進行產氣桿菌培養(yǎng)，菌體初始濃度X0=0.1kg/m3,培養(yǎng)至3.2h,菌體濃度為8.44kg/m3 ，若不考慮延遲期，而且一定，求td,二 Monod方程 隨溫度、pH、基質濃度、產物濃度、溶氧等條件而變化. f(s,p,T,pH,) Monod發(fā)現(xiàn)：在一定條件下(基質限制) f(S) 經驗公式：m S/ (Ks + S),：菌體的生長比速（1/h） S：限制性基質濃度（g/L） Ks：飽和常數(shù)(相當于1/2m時的限制性基質濃度, g/L ) max: 最大生長比速（1/h）,：菌體的生長比速 S：限制性基質濃度 Ks：飽和常數(shù)(相當于1/2m時 的限制性基質濃度, g/L ) max: 最大生長比速（1/h）,S Ks時，S直線關系 S Ks 時，m， Ks與m反映了微生物的特征：基質 Ks反映微生物對基質的親和力：Ks小，親和力大,Monod方程的參數(shù)求解(雙倒數(shù)法)： Ks與m,將Monod方程取倒數(shù)可得：,或：,這樣通過測定不同限制性基質濃度下，微生物的比生長速度，就可以通過回歸分析計算出Monod方程的兩個參數(shù)。,例：在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)：,S(mg/l) 6 33 64 153 221 (h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70,求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的max，Ks和td?,解：將數(shù)據(jù)整理：,S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221,max，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L,tdln2/ max0.64 h,第三節(jié) 產物形成動力學,一、初級代謝產物和次級代謝產物,次級代謝產物：還有一類產物，對細胞的代謝功能沒有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等 這一類化合物稱為次級代謝產物。,初級代謝產物：微生物合成的主要供給細胞生長的一類物質。 如氨基酸、核苷酸等等，這些物質稱為初級 代謝產物。,二、發(fā)酵動力學類型（產物形成和菌體生長關系）：,一類發(fā)酵偶聯(lián)型 產物的形成和菌體的生長相偶聯(lián),x,p,t,二類發(fā)酵混合型 產物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián),x,p,t,三類發(fā)酵非偶聯(lián)型 產物的形成和菌體的生長非偶聯(lián),x,p,t,濃 度,三 在分批發(fā)酵過程中，微生物生長、產物形成均與基質利用 有關，因此可建立平衡方程： 微生物生長：細胞積累生長 dX/dt = X 產物形成：產物積累產物合成 dP/dt = X Yp/x = qpX 基質利用：基質積累生長消耗產物消耗維持 dS/dt =X/Yx/sqpX / Yp/s mX = qs X qpX / Yp/s mX 比速率（、qp、qs）：單位時間內單位細胞濃度所引起的細胞生長或產物形成或底物消耗的量。（g /g細胞.h） 生長得率Yx/s ；產物得率 Yp/s,四. 生產得率系數(shù)和產物得率系數(shù) 1. 生產得率系數(shù)： Yx/s表示每消耗1mol的基質所形成的菌體質量（g） Yx/s X/SX-X0/S0-S Yx/o2 表示每消耗1mol的O2所形成的菌體質量（g） Yx/s X/O2 Yx/ATP 表示每消耗1mol的ATP所形成的菌體質量（g） Yx/s X/ATP 2. 產物得率系數(shù)： Yp/s表示每消耗1mol的基質所生成的產物質量（g） Yp/s P/SP-P0/S0-S,五. 分批培養(yǎng)的生產率 1.分批培養(yǎng)的生產率（Productivity）： 生產率P=細胞或產物濃度（g/ L）/發(fā)酵時間t(h） 其中：發(fā)酵時間t = 1/m ln Xf/X0 + tc + tf + tl tc 為放罐清洗時間； tf 為裝料消毒時間； tl為生長停滯時間。 X0 、Xf 分別為細胞最初與最終濃度。 若令: tc + tf + tltL 則： P （Xf X0 ） m /ln（Xf /X0）+m tL,1. 在5m3的培養(yǎng)液中按5%接種量接種，原接種液含菌5106（個/mL），求菌含量為4109（個/mL）的培養(yǎng)時間。（假定培養(yǎng)期間均SKs, m=0.8 h1） 2. 采用合成培養(yǎng)基，在1m3的反應器中對大腸桿菌進行分批培養(yǎng)，菌體生長可用Monod方程描述。已知m=0.935 h1，Ks=0.71 kg/m3,基質初始濃度S=50 kg/m3，菌體初始濃度X0=0.1 kg/m3,菌體得率YX/S=0.6kg/kg(細胞/基質)。問:當80基質已消耗所需時間。 3.以甘油為基質進行陰溝氣桿菌分批培養(yǎng)。時間t=0，X0=0.1g/L, S0=50g/L.，菌體生長可用Monod方程描述，m=0.85 h1，Ks=1.23102g/L，YX/S=0.6kg/kg(細胞/葡萄糖)。 不考慮誘導期和死亡期，求培養(yǎng)6h后的菌體濃度及底物濃度。,第三節(jié) 連續(xù)培養(yǎng)及其動力學 連續(xù)培養(yǎng)（cintinuous culture）有稱連續(xù)發(fā)酵，以一定速度向發(fā)酵罐注入新鮮培養(yǎng)基，同時以同速排出培養(yǎng)液。使罐內液量維持恒定，使培養(yǎng)物在恒定狀態(tài)下生長的培養(yǎng)方法。 連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)的區(qū)別：維持恒定狀態(tài)環(huán)境條件如基質濃度S、產物濃度P、細胞濃度X、比生長速率、pH等始終維持不變 維持恒定狀態(tài)目的：穩(wěn)定高效的培養(yǎng)微生物或產生大量代謝產物。,一 單罐連續(xù)發(fā)酵的前提和假設： 穩(wěn)定狀態(tài)下物料平衡，參數(shù)變化為零：dX/dt=0, dS/dt=0, dP/dt=0； 培養(yǎng)基混合均勻，菌體、基質、含氧等均勻一； 微生物無死亡（比死亡速率0）,單罐連續(xù)培養(yǎng),流入速度=流出速度=F,反應器內(V)全混流溶質濃度處處相等,連續(xù)反應器：,二 單罐連續(xù)發(fā)酵的動力學 通過連續(xù)培養(yǎng)的物料衡算來推導其動力學方程： 微生物細胞的物料平衡： 積累細胞（進入流出）細胞（生長死亡）細胞 dX/dt = F（X0X）/V()X 由于流入細胞濃度X00，0，故簡化為: dX/dt = FX / VX（F/ V）X 穩(wěn)定態(tài)下: dX/dt =0 則：F/ V,連續(xù)培養(yǎng)中，稀釋率（dilution rate）D = F/V, 故：D D (1/h)：單位時間內新進入的培養(yǎng)液體積（F）占罐內培養(yǎng)液總體積(V)的分數(shù)。 1/D (h)：培養(yǎng)液在罐內的平均停留時間，可用t表示 注： D =F/V，可通過改變F（流加速率）調節(jié)值： D0, 微生物濃度將隨時間而增加； D, 則dX/dt 0, 微生物濃度將隨培養(yǎng)物被洗出（wash out）而減少； D, 則dX/dt 0，微生物濃度不隨時間而變化，處于恒態(tài) 連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài),限制性底物的物料平衡： 底物積累（進入流出）底物（生長形成 產物維持代謝）底物 dS/dt = F（S0S）/V（X/Yx/sqpX/Yp/smX） 由于mXX/Yx/s，產物形成的需求（qpX/YP/s）忽略時，該式簡化為： dS/dt = F（S0S）/VX/Yx/s 穩(wěn)定態(tài)下 dX/dt =0 則：D（S0S）=X/Yx/s 當穩(wěn)定態(tài)D=時，XYx/s（S0S） （1）,其中： S0，S流入和流出的營養(yǎng)底物的濃度（g/L）； F培養(yǎng)液體積流量（L/h）； V反應器容積(L)； m維持系數(shù)（g基質/g細胞.h）； 比生長速率（h1）； Yx/s以消耗基質為基準的細胞得率 （g細胞/g基質）； Yp/s以消耗基質為基準的產物生成率 （g產物/g基質）,3）細胞濃度與稀釋率的關系 據(jù)Monod方程: m S/ (Ks + S) 當穩(wěn)定態(tài)D=時, D Dc S /(Ks + S) Dc:臨界稀釋速率（Dc=m）,代表能運行的最大稀釋 速率。 一般情況下DDc；DDc, 則菌體將被洗出 上式變形為： SDKs / (m - D) (2) (1),(2)合并：XYx/sS0DKs / (m - D) （3）,注： 連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)下，Yx/s、S0、Ks及m均定值，故菌種濃度X、底物濃度取決于稀釋率D。 連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)下，X、S0、D為主要變量，其他屬于因變量。但當D發(fā)生改變，均會造成X、S、的變化。 菌種濃度X、基質濃度S、細胞產率P及稀釋率D 的變化關系如圖：,菌種濃度X與稀釋率D的關系： 隨D增加，X逐漸減少，起初 不明顯，當D漸接近Dcm， X急跌至0，微生物全部洗出。 基質濃度S與稀釋率D的關系： S變化與X相反：一般當D0.8 時,S很??；隨D再增大，S急劇 上升，當D漸接近Dcm時， SS0。 細胞產率P=DX與稀釋率D的關 系： 隨D的增加P逐步增大，可達最 大DX值（DmXm），Dm為理論上 的最適宜稀釋速率。,菌種濃度X、基質濃度S、細胞產率P及稀釋率D的關系 Dc為臨界稀釋速率； Dm為理論上的最適宜稀釋速率。,三 連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵生產率的比較 1分批培養(yǎng)的生產率 P分=(Xf X0) / 1/m* ln(Xf / X0) + tL 2連續(xù)發(fā)酵的生產強度P連為稀釋率D與菌體濃度X 之積 P連DXD Yx/sS0DKs / (m - D) 3連續(xù)培養(yǎng)與分批培養(yǎng)之比： P連/P分=