實驗二α-淀粉酶的初步純化.ppt

實驗二 -淀粉酶的初步純化,一、實驗目的,掌握酶制劑提取工藝流程。 掌握淀粉酶的分離方法、純化方法、濃縮方法和干燥方法。,二、實驗原理,發(fā)酵液,預處理（細菌絮凝）,固液分離（離心、過濾）,菌體（胞內酶） 動植物源酶,液體（胞外酶）,細胞破碎,提取,固液分離,液體,工業(yè)、食品、飼料,濃縮 （蒸發(fā)、超濾、沉淀）,濃縮液,配方,干燥,醫(yī)藥、分析、科研,液體酶,固體酶,濃縮,分離純化 （離心、沉淀、膜分離、 層析、電泳、萃取、結晶）,配方、制劑,干燥,液體酶,固體酶,二、實驗原理,-淀粉酶是一種胞外酶，胞外酶的初步分離純化通常是將發(fā)酵液經過預處理后采用過濾或離心的方法將酶液與菌體分離，然后在酶液中加入(NH4)2SO4 鹽析沉淀獲得酶泥，最后干燥即可。,二、實驗原理,在酶的分離純化過程中，每步都需要測定酶活力、體積，以計算酶的總活力和比活力，進而計算酶活力回收率和純化倍數(shù)，以監(jiān)測每步純化步驟中酶的回收和純化效果，從而可以判斷每步所使用的純化手段是否適宜目的酶的分離。,二、實驗原理,鹽析法是蛋白質溶液中加入鹽到一定限度后繼續(xù)加鹽，蛋白質從溶液中析出。其原理主要是蛋白質在高鹽離子濃度下表面電荷被中和，水膜被破壞，蛋白質分子間疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。 Ks分段鹽析 、分段鹽析,二、實驗原理,有機溶劑沉淀法是利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離。 有機溶劑之所以能使酶沉淀析出是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。從而使溶質分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集。 有機溶劑與水相互作用，破壞溶質分子表面的水膜，使其溶解度降低而沉淀析出。,三、儀器和試劑,儀器： 分光光度計、恒溫水浴鍋（控溫精度0. 1）、干燥箱、離心機、移液管、試管、燒杯、容量瓶、玻璃棒、三角瓶、秒表、標簽、培養(yǎng)皿、量筒、漏斗、中速濾紙。 試劑： 碘、碘化鉀、 -淀粉酶制劑、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸、可溶性淀粉（湖州展望化學藥業(yè)有限公司）、氯化鈣、磷酸氫二鈉、硫酸銨、乙醇。,四、實驗方法,發(fā)酵液的預處理 將發(fā)酵液收集起來，過濾濾去菌體，收集濾液，測量其體積。取5 mL出來留作淀粉酶的活力測定，剩余發(fā)酵液則進行初步純化。在剩余發(fā)酵液中加入CaCl2 和Na2HPO4 各0.8%-1%進行絮凝作用，并加熱到5560 處理30 min，以破壞蛋白酶，促使膠體凝聚后再過濾，收集濾液，測量其體積，并測酶活力(留樣下次實驗時候測定）。,四、實驗方法,硫酸銨鹽析沉淀-淀粉酶 取100ml濾液，按硫酸銨的飽和度為55的比例，將硫酸銨緩慢加入到收集的濾液中，一邊加(NH4)2SO4，一邊輕輕攪拌。盡量避免液面泛起白色泡沫。完全溶解后在4下沉淀過夜，使上清液中的蛋白質沉淀下來。次日將三角瓶取出，將溶液以4 000 rmin-1 轉速離心15 min，收集沉淀，然后在烘箱中于5060 干燥（損失率應不高于30），即得粗酶制劑。,四、實驗方法,有機溶劑沉淀-淀粉酶 在50ml濾液中，一邊緩慢加入冰凍乙醇，一邊輕輕攪拌，至乙醇終濃度為70%，觀察有無沉淀析出。亦可在4下沉淀過夜，使上清液中的蛋白質沉淀下來。次日將三角瓶取出，將溶液以4 000 rmin-1 轉速離心15 min，收集沉淀，室溫風干，即得粗酶制劑。,五、實驗結果,酶的總活力（即酶產量） 酶液總體積酶的比活力 酶的純化倍數(shù) 某純化步驟的比活力/第