乳酸菌菌種的分離篩選方法.doc

乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細(xì)菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。為兼性厭氧菌，桿狀或球狀，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運(yùn)動。營養(yǎng)要求高，需要提供豐富的肽類 氨基酸 維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類時，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對于芽孢乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬的一個種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動，無鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.61.0m，在直角兩個平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運(yùn)動，兼性厭氧。在MRS培養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀。乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時先富集培養(yǎng)并選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫-80等物質(zhì)，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細(xì)菌生長，對乳酸菌無害。培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據(jù)，通過對生成的乳酸量進(jìn)行性能鑒定。乳酸菌生長繁殖時需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養(yǎng)基一般可添加西紅柿 酵母膏 油酸 吐溫等物質(zhì)，均具有促進(jìn)生長作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細(xì)菌的生長，對乳酸菌無害。一.篩選方法：1.溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細(xì)菌在含CaCO3的培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3溶解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入CaCO3的作用是：鑒別能產(chǎn)生酸的細(xì)菌；中和產(chǎn)生的酸，以維持培養(yǎng)基的PH。篩選過程：樣品預(yù)處理梯度稀釋至10-6選擇合適的稀釋度涂布37培養(yǎng)48h挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在MRS培養(yǎng)基上劃線挑起單菌落染色，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種挑選革蘭氏陽性單菌落試管穿刺4冰箱保存。2.溴甲酚綠指示劑法：培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（含溴甲酚綠酒精溶液）篩選過程：同上，不同之處是稀釋涂布后長出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌落。二.菌種的分離篩選1.培養(yǎng)基：1.1麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基：麥芽汁（10BX）1L 預(yù)先滅菌碳酸鈣5-10g/L PH自然 （分離用）1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐溫0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚綠 0.01% PH6.0-6.5（分離用）1.3番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基：酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐溫 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分離用）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.51.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/LMgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.51.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米漿0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5 （發(fā)酵或種子培養(yǎng)基）1.7 MRS培養(yǎng)基 （分離培養(yǎng)計(jì)數(shù)用）蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 檸檬酸氫二銨 2.0g、葡萄糖 20.0g、 吐溫 80 1.0mL、 乙酸鈉 5.0g、 磷酸氫二鉀 2.0g、硫酸鎂 0.58g、硫酸錳 0.25g、瓊脂 18.0g、 蒸餾水1L, pH 6.5。（分離培養(yǎng)基），當(dāng)MRS培養(yǎng)基冷卻至4550時,加入已滅菌的碳酸鈣, 充分混勻,倒平板。1.8 BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5溴甲酚紫10ml 自來水1000ml pH6.5-7.0 （分離用）1.9 BCG牛乳營養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6溴甲酚綠酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取瓊脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g 溶解后調(diào)pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁熱在無菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37培養(yǎng)24h，檢查是否有雜菌。2.分離篩選：2.1富集培養(yǎng)：取1.0g（1.0ml）于無菌細(xì)口瓶中，加入無菌麥芽汁液體培養(yǎng)液于瓶口處，密閉，25-32培養(yǎng)48h。若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接2-3次，接種量3-5.2.2菌種分離純化：溶鈣圈法：富集菌液或樣品適當(dāng)稀釋至10-7，混菌法分離，先加入10-12ml MRS培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，凝固后再注入4-5ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，30或37培養(yǎng)2-3天（溫度低時間稍長），可出現(xiàn)針頭狀或圓形稍扁菌落，周圍形成透明圈。挑取透明圈大，培養(yǎng)基變黃的菌落， 反復(fù)劃線純化2-3次，所得單菌落編號，經(jīng)鏡檢后，疑似乳酸菌落接種于MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后保存?zhèn)溆??；蚪尤胍后w培養(yǎng)基中，25-32培養(yǎng)24-48h，然后穿刺于MRS培養(yǎng)基或麥芽汁碳酸鈣半固體培養(yǎng)基中，25-32培養(yǎng)48h保存?zhèn)溆谩?.3性能測定：乳酸菌定性試驗(yàn)：不同條件下的產(chǎn)酸速率試驗(yàn)：將分離菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中25 37溫度下培養(yǎng)測不同菌株不同溫度的pH。方法1.吸取發(fā)酵液10ml，注入空試管中，加入10硫酸1.0ml，在加入2.0高錳酸鉀約1.0ml，此時乳酸轉(zhuǎn)化成乙醛。取濾紙一條，在含氨的硝酸銀溶液中浸濕，橫搭在試管口上，將試管徐徐加熱至沸騰，使乙醛揮發(fā)，若管口濾紙變黑，證明有乳酸生成。方法2.紙層析法：展開劑為正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛細(xì)血管吸取發(fā)酵液，多次點(diǎn)樣于新華濾紙上，1.5標(biāo)準(zhǔn)乳酸為對照，平衡2小時后進(jìn)行層析，3溴甲酚藍(lán)顯色計(jì)算Rf值。產(chǎn)酸量測定：5.0ml發(fā)酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸餾水10-20ml，酚酞指示劑2滴，用0.1mol/l氫氧化鈉滴定至微紅色。醋酸量（g/100mL）= 氫氧化鈉摩爾濃度.Vx90.08x10-3 /樣品毫升數(shù) x100同時，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察醋酸速度，耐高溫，耐酒精度，耐低酸度等主要生產(chǎn)性能，選擇優(yōu)勢菌株。3.菌株鑒定：3.1菌落形態(tài)：3.2菌體形態(tài)：（革蘭氏染色觀察）染色鏡檢：桿狀 陽性。3.3乳酸菌運(yùn)動性檢測：半固體穿刺法3.4生理生化：3.3.1生化試驗(yàn)：產(chǎn)過氧化氫，產(chǎn)硫化氫，葡萄糖產(chǎn)生，硝酸鹽還原，產(chǎn)生吲哚，甲基紅，明膠液化，需氧，精氨酸，糖發(fā)酵試驗(yàn)。3.3.2生理試驗(yàn)：乳酸菌產(chǎn)酸能力曲線：將篩選的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，25-32培養(yǎng)48h，間隔4-6h測定發(fā)酵液pH。食鹽對乳酸菌的影響：在MRS液體培養(yǎng)基中，添加0.0 2.0 4.0 6.0氯化鈉，菌種分別接種于培養(yǎng)基中，32培養(yǎng)48h，測定OD值。溴甲酚綠指示劑法：原理：溴甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境呈藍(lán)色，分離培養(yǎng)基配制后PH為6.8，加入溴甲酚綠指示劑呈藍(lán)綠色，產(chǎn)酸后菌落周圍變成黃色，較容易鑒別。培養(yǎng)基：BCG牛乳營養(yǎng)瓊脂初篩：將樣品富集液梯度稀釋，適溫培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)扁平的黃色菌落及周圍培養(yǎng)基也為黃色初定為乳酸菌。復(fù)篩：將典型菌落轉(zhuǎn)接脫脂乳發(fā)酵管，若凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色陽性，連續(xù)傳代若干次培養(yǎng)，挑選出3-4h能凝固的乳管保存?zhèn)溆?。注?.乳酸菌篩選常在幾種培養(yǎng)基同時進(jìn)行： 分別在麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基，番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）同時進(jìn)行混菌 劃線或涂布培養(yǎng)（放厭氧袋），分別25 37培養(yǎng)48h。菌落觀察：平板表面形成淺色（黃色或白色）小菌落。麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基表面，菌落周圍形成透明圈，BCP培養(yǎng)基（溴甲酚紫培養(yǎng)基）周圍使紫色的培養(yǎng)基形成黃色包圍圈。觸酶反應(yīng)：厭氧菌一般無觸酶（過氧化氫酶），用滴管滴加3.0過氧化氫于菌落上，若無氣泡產(chǎn)生，證明該菌為觸酶陰性。將各種特征菌落分別接入斜面，培養(yǎng)后保存，進(jìn)一步生理生化試驗(yàn)，以鑒定分別何種乳酸菌。2.菌落鑒定：半固體或雙平板瓊脂利于乳酸菌的生長，菌落出現(xiàn)早。2.1菌落形態(tài)觀察：乳白色 邊緣不整齊，稍呈半球狀凸起，實(shí)心菌落。 個體形態(tài)：半透明 細(xì)桿狀 鏈狀排列，大量時呈發(fā)絲狀堆積。初步認(rèn)為乳桿菌。2.2生化鑒定：在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種試管無任何變化，為陰性反應(yīng)。說明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。明膠液化 淀粉水解 氫氧化鉀試驗(yàn)均為陰性，說明此菌為乳酸菌。（過氧化氫酶 還原硝酸鹽）糖發(fā)酵試驗(yàn)：發(fā)酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖產(chǎn)酸為陽性反應(yīng)，其余麥芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖產(chǎn)酸為陰性反應(yīng)。根據(jù)手冊第九版判斷此種乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種。（纖維二糖 甘露醇 山梨醇 七葉苷 水楊苷）2.3乳酸菌生長曲線 pH-t測定結(jié)果： 三.幾種乳酸菌篩選舉例1.嗜熱鏈球菌：樣品來源：市售酸奶 培養(yǎng)基：M17改良培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：42，需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離2.保加利亞乳桿菌