實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用.doc

實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用 周雪花 云南省文山州疾病預(yù)防控制中心，云南文山663000 摘要目的探討實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用效果。方法選取xx年9月xx年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件進(jìn)行分析，采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進(jìn)行檢測，觀察檢測陽性率和陽性樣本的類型，以分析流感的流行趨勢。結(jié)果xx年9月xx年12月共檢出流感病毒核酸陽性676件，檢測陽性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。每年69月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在1011月達(dá)到高峰期；69月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，1011月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。結(jié)論實時熒光定量PCR是一種科學(xué)有效的檢測方法，可對流感病毒核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。 關(guān)鍵詞實時熒光定量pcr；流感；病毒核酸；檢測；應(yīng)用 R440A1672-5654（xx）10（a）-0178-02 作者簡介周雪花（1977-），女，漢族，本科，主管檢驗師，云南文山人，主要從事臨床檢驗，微生物檢驗工作。 xx年3月份在墨西哥爆發(fā)甲型H1N1流感，并且迅速蔓延至全球，使人們意識到預(yù)防流感的重要性1-2。為了探討實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用效果，本文選取xx年9月xx年12月在我市某地區(qū)采集的流感樣病例咽拭子2489件作為研究對象進(jìn)行分析，結(jié)果匯報如下。 1資料與方法 1.1一般資料 于xx年9月xx年12月在我州采集的流感樣病例咽拭子2489件。 1.2方法 1.2.1采集2489件咽拭子是擦拭雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁，剪去一部分放置在無菌病毒采樣液中，以4的條件下保存，盡快送至實驗室，其中疑似甲型H1N1病毒的病例采用A類包裝。 1.2.2試劑和儀器采用STRATAGENEMX3000P實時熒光定量PCR儀。試劑盒采用QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)病毒核酸提取試劑盒，及其配套的試劑，其陽性檢測結(jié)果對比參照試劑盒配套說明書。 1.2.3檢測方法RT-PCR快速檢測試驗步驟 （1）流感病毒核酸提取QIAGEN公司的RneasyMiniKit(Catalog#74104)：取一支無菌、無酶的1.5mlEppendorf管，加入500ulRLT。取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）100uL，加入上述Eppendorf管中。加5uL-巰基乙醇，充分混勻。加600uL70%乙醇，于旋轉(zhuǎn)混合器混勻。從試劑盒中取出帶濾膜的離心柱，并標(biāo)上標(biāo)本號。將第4步的混合液分兩次（每次600uL）吸入于濾柱中，12000rpm離心15s，棄收集管中的離心液。濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm離心15s，棄收集管中液體。于濾柱中加入700uLRW1，12000rpm離心15s。從試劑盒中取出一支新的2mL收集管，將離心后的濾柱轉(zhuǎn)到新的收集管上，于柱子中加入500ulRPE，12000rpm離心15s棄收集管中液體。濾柱放回收集管上，于濾柱中加入500uLRPE，1300014000rpm離心2min。從試劑盒中取出一支1.5mLEppendorf管，將濾柱轉(zhuǎn)到新的1.5mL管上，于濾柱中加入3050uL無RNA酶的水，室溫靜置13min。12000rpm離心1min，棄濾柱。收集的離心液即為提取病毒的RNA，可以直接用于逆轉(zhuǎn)錄實驗，或在-20以下保存，-30可保存34個月。 注意事項：試劑盒中的RPE液用前需加44mL無水乙醇，使終體積達(dá)到55mL；所有用過的槍頭、收集管放入2%次氯酸鈉消毒缸中過夜；每步均需要更換槍頭。 （2）在潔凈緩沖間、二級生物安全柜配制RTPCR(realtimePCR)反應(yīng)液。（以下均存-20）： 一對特異引物和寡核苷酸探針（季節(jié)性FLuA、FLuB、H1、H3、H5、H7、H9等）。 手掌型離心機(jī)離心1520s后（防止突然開蓋引物和探針飄走），按各自標(biāo)注的OD值加入無酶水，混勻，離心即為儲備液。依據(jù)說明書，各相應(yīng)的一對特異引物（F、R）按2.5倍稀釋、寡核苷酸探針（P）按5倍（有的為10倍稀釋）即為使用液 各季節(jié)性流感反應(yīng)體系（按n+2用量配制）及其反應(yīng)條件(需根據(jù)引物調(diào)整)。 RT-PCRMasterMix12.5uL605min/5030min/9515min(1個循環(huán)) RT-Mix0.25uL9515s/5530s/(收集熒光)/7230s DH2O5.75uL（45個循環(huán)） F(5上游引物使用液)0.5uL725min（1個循環(huán)） R(3下游引物使用液)0.5uL P（寡核苷酸探針使用液）0.5uL 新甲型H1N1(豬甲流-xx)北京金豪試劑反應(yīng)體系（按n+2用量配制）及其反應(yīng)條件。 H1N1各反應(yīng)液2000rpm離心10s5030min/953min（1個循環(huán)） （FLuA、SWH1、SWFFLuA、RNP內(nèi)標(biāo)）各20uL9515s/5030s/721min 各反應(yīng)液分別加逆轉(zhuǎn)錄酶0.35uL（5個循環(huán)） DNA聚合酶1uL （混勻離心）9510s/5540s(收集熒光)（45個循環(huán)） 于提取間，反應(yīng)體系20uL+模板RNA提取液5uL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。陽性：Ct值35.0，并且呈現(xiàn)S形曲線,陰性：Ct值為0。 1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用2檢驗，計量資料采用t檢驗，用（xs）表示，P0.05說明具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2結(jié)果 2.1流感病毒核酸檢測陽性率 xx年9月xx年12月的2489件流感樣病例咽拭子中，共檢出流感病毒核酸陽性676件，陽性檢出率為27.16%；其中甲型H1N1病毒472件，占69.82%；季節(jié)性甲3亞型病毒126件，占7.54%；季節(jié)性甲1型病毒21件，占3.11%；乙型病毒6件，占0.89%；各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。結(jié)果見表1。 2.2流感病毒流行特征 每年69月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢，在10月次年3月達(dá)到高峰期；69月以季節(jié)性甲3亞型病毒為主要流行病株，10月次年3月甲型H1N1病毒成為主要流行病株。 3討論 流感之一種急性呼吸系統(tǒng)疾病，主要由流感病毒引起，臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、酸痛、乏力、呼吸道癥狀等。流感傳染性強(qiáng)、潛伏期短、傳播迅速，可分為甲、乙、丙三種類型，其中以甲型流感對人們的威脅最大3-4，因而必須加強(qiáng)對流感的檢測和防控。 流感病毒致病能力較強(qiáng)，而且容易發(fā)生變異，而且人們對特異性菌株缺乏必要的免疫力，因而會導(dǎo)致流行暴發(fā)。相關(guān)研究表明，一場大型流感會導(dǎo)致整個地區(qū)的壽命降低5，因而必須加強(qiáng)流感的防控，為此我市疾病防控中心采用實時熒光定量PCR對流感病毒核酸進(jìn)行檢測，取得了良好的效果。 實時熒光定量PCR檢測具有明顯的優(yōu)點，相比于普通的RT-PCR檢測來說，其實驗周期更短，靈敏度更低，而且不容易造成實驗室污染6。實時熒光定量PCR檢測能夠利用PCR對DNA的高效擴(kuò)增、光譜技術(shù)的敏感性和探針技術(shù)的特異性，敏感性較高，重復(fù)性好，而且更為直觀，操作簡單，容易操作，采用閉管檢測對實驗室的污染能夠降到最低，因而具有良好的實用性；采用磁珠法進(jìn)行提取核酸，能夠最大限度的結(jié)合核酸，而且清洗效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)自動化提取，操作方便7-8。 通過本研究發(fā)現(xiàn)，xx年9月xx年12月共檢出流感病毒核酸陽性676件，檢測陽性率為27.16%；其中甲型H1N1病毒最多，各類型流感病毒發(fā)生率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。此外，每年9月次年的3月甲型H1N1病毒流感呈上升趨勢。這充分證明了實時熒光定量PCR檢測的優(yōu)勢。 但是在實驗室檢測中要注意以下幾點：要對實驗室區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格區(qū)分，不同實驗區(qū)域采取不同的專屬器械；在樣品提取后能夠進(jìn)行立刻檢測的要進(jìn)行立刻檢測，否則會降低檢驗的準(zhǔn)確率，如果無法立即進(jìn)行檢測要進(jìn)行冷凍保存；整個檢測過程要在低溫環(huán)境下進(jìn)行；移動液也進(jìn)行嚴(yán)密的校準(zhǔn)，操作過程要熟練，防止發(fā)生遺漏事件的發(fā)生；要注重檢測過程中的污染問題，采取75%的乙醇對實驗臺面進(jìn)行擦拭，對周圍環(huán)境采取紫外線消毒，以減少污染的發(fā)生9；另外，相關(guān)研究也證明10，盡管檢測流感病毒核酸的試劑和儀器很多，但是并不是所有的試劑與儀器都能達(dá)到的最好的匹配，因此，在進(jìn)行實驗室檢測時還要多次進(jìn)行校準(zhǔn)試驗，針對不同的試劑和儀器進(jìn)行匹配性試驗比較，找出最佳匹配方案，使實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果更加快速、準(zhǔn)確，敏感性、特異性更高。 綜上所述，實時熒光定量PCR是一種科學(xué)有效的檢測方法，可對流感病毒核酸進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，分析流感病毒的流行規(guī)律，有效預(yù)防突發(fā)公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。 參考文獻(xiàn) 1葛琴娟，楊靜，孫晉飛，等.實時熒光定量PCR法檢測鎮(zhèn)江市流感樣病例樣本的結(jié)果與分析J.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，xx，17(4)：755-757. 2劉建榮，宋淑娥，何瑩，等.實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用J.職業(yè)與健康，xx，1(9)：1000-1002. 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