TNP┐470對結腸癌Lovo細胞生長的抑制作用.doc

TNP470對結腸癌Lovo細胞生長的抑制作用【關鍵詞】結腸腫瘤關鍵詞:TNP-470；Lovo細胞；脫噬作用；結腸腫瘤摘要:目的探討TNP-470對體內(nèi)外人結腸癌Lovo細胞生長的影響.方法采用MTT法檢測TNP-470對體外培養(yǎng)的Lovo細胞的生長抑制作用.建立結腸癌皮下移植瘤模型，16只裸鼠平均分為治療組（TNP-47030mgkg-1）和對照組（相同體積的生理鹽水），4wk后處死裸鼠，測量腫瘤體積.腫瘤組織行病理學檢查，采用HE染色和TUNEL原位末端標記術檢測體內(nèi)腫瘤細胞的凋亡情況.結果TNP-470作用72h，明顯抑制體外培養(yǎng)的Lovo細胞的生長，IC50為55.8gL-1.TNP-470顯著抑制了體內(nèi)腫瘤的生長，治療組腫瘤體積為（73140）mm3，對照組為（134538）mm3，（P<；0.01）.治療組Lovo細胞凋亡率為（21.42.1）%，對照組為（7.51.5）%，（P<；0.001）.結論TNP-470能夠抑制結腸癌Lovo細胞的體內(nèi)外生長，其機制可能與誘導細胞凋亡有關.Keywords:TNP-470；Lovocells；apoptosis；colonicneo-plasmsAbstract:AIMTostudytheeffectofTNP-470onthegrowthofhumancoloncancercellline，Lovocells，invitroandinvivo.METHODSGrowthinhibitoryeffectofTNP-470onLovocellswasexaminedbyanMTTassay.Humancoloncancerxenograftswastransplantedinto16nudemice.TNP-470（30mg/kg）orthesamevolumeofsalinesolutionwasadministeredonalternativedaystarting1daysaftertu-morimplantation.Miceweresacrificedafter4weeksandtu-morswereprocessedforhistologicalexamination.Inboththetreatmentandcontrolgroups，tumorvolumeswerecountedandapoptosesofLovocellsweremeasuredusingHEstainingandTdT-mediatedbiotinyated-dUTPnickendlabeling（TUNEL）method.RESULTSInvitro，TNP-470inhibitedthegrowthofLovocells，withitsIC50at55.8gL-1.Invivo，tumorvolumes（134538）mm3vs（73140）mm3，P<；0.01）weresignificantlyreducedintheTNP-470groupcomparedwiththecontrolgroup.Apoptosisindexes（AI）ofLovocellswerestatisticallydifferentbetweenthetwogroups（21.42.1）%vs（7.51.5）%，P<；0.001）.CONCLUSIONTNP-470isapotentagenttoinhibittumorgrowthofcoloncancerinvitroandinvivoandthisinhibitoryeffectmaybeassociatedwithapoptosis.0引言血管生成抑制劑TNP-470通過抑制血管內(nèi)皮細胞生長和遷移，進而抑制腫瘤新生血管形成.TNP-470還能抑制體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞的生長，但對于TNP-470抑制腫瘤細胞生長的機制，研究結果不盡相同.我們通過MTT法檢測TNP-470對結腸癌Lovo細胞的生長抑制作用，采用裸鼠皮下移植瘤模型，觀察TNP-470對移植瘤生長及Lovo細胞的凋亡的影響，探討TNP-470抗瘤作用的機制.1材料和方法1.1材料雌性4wk齡BABL/c裸鼠，體質(zhì)量1722g，第一軍醫(yī)大學動物實驗中心提供.結腸癌Lovo細胞株由第一軍醫(yī)大學消化研究所傳代保存.RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生小牛血清等均購自杭州四季青生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司，原位末端標記（TUNEL）試劑盒購自基因公司.TNP-470由日本大阪Takeda化學公司HiroshiFukui博士惠贈.1.2方法1.2.1Lovo細胞增殖抑制實驗采用MTT法檢測TNP-470對LOVO細胞生長抑制率.將對數(shù)生長期的Lovo細胞置96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，48h后實驗組加入不同濃度的TNP-470（510-45105gL-1），每個濃度設6個復孔，對照孔加入相同體積不含TNP-470的RPMI1640培養(yǎng)基，并設空白對照孔（無細胞，僅含RPMI1640培養(yǎng)基）.培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT（5gL-1）20L，37反應4h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150L二甲亞砜（DMSO），充分溶解后在Bio-Rad550型酶標儀570nm下測吸光度（A）值.按下列公式計算細胞生長抑制率:生長抑制率（%）=（對照組平均A-實驗組平均A）/（細胞對照組A-空白對照組A）100%.1.2.2皮下移植瘤抑制實驗收集培養(yǎng)3d的Lovo細胞，生理鹽水制成懸液，用1.0mL微量注射器將0.2mL細胞懸液（51065107）注入2只裸鼠頸部皮下.注射前注射部位消毒，4d后重復接種1次.當接種部位腫瘤長至1520mm時，無菌條件下取材.將腫瘤組織剪成1.52.0mm小塊，置于生理鹽水中備用.裸鼠以20gL-1氯胺酮0.20.3mL麻醉成功后，乙醇消毒接種部位皮膚，將切好的腫瘤組織塊置于18號套管針口，分批接種于裸鼠背部皮下.16只裸鼠隨機分成2組，兩組裸鼠體質(zhì)量差異無顯著性.手術當天給藥，TNP-47030mgkg-1，sc，qod，對照組給相同體積的生理鹽水.接種30d后斷頸處死裸鼠，測量腫瘤體積，計算抑瘤率.將腫瘤組織于40gL-1中性甲醛固定24h，石蠟包埋，連續(xù)切片（4m），常規(guī)HE染色及TUNEL標記染色.抑瘤率（%）=（對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積）/對照組腫瘤體積100%.1.2.3TUNEL染色檢測凋亡細胞TUNEL染色具體步驟如下:切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水至水化，滴加20mgL-1蛋白酶K，室溫消化15min，去離子水洗5min2，30mLL-1過氧化侵氫甲醇液中室溫下封閉10min，0.05molL-1PBS洗5min2，向組織片滴加平衡緩沖液，室溫下孵育60min，濾紙吸取標本周圍液體，迅速滴加TdT酶，置濕盒中37孵育60min，室溫下切片入終止緩沖液中振蕩孵育10min，0.05molL-1PBS洗2min3，滴加過氧化物酶，室溫下濕盒中孵育30min，0.05molL-1PBS洗2min4，DAB顯色510min，甲基綠復染10min，脫水、透明、封片.以0.05molL-1PBS替代TdT酶作為陰性對照.結果判定:以細胞核陽性為標準，凋亡細胞呈棕黃色細顆粒狀或彌散性，散在或簇狀分布于腫瘤組織中，個別者核膜增厚，呈棕黃色染色.結合HE染色，選擇無細胞壞死的5個視野或HE染色證實為壞死的細胞不計數(shù)，采用德國KontronIBAS2.5型全自動圖像分析系統(tǒng)對TUNEL染色陽性細胞進行計數(shù)，每個視野計數(shù)1000個以上細胞，以陽性細胞所占百分率作為凋亡指數(shù)（apoptosisindex，AI），取5個視野AI均值進行統(tǒng)計學分析.統(tǒng)計學處理:所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)標準差（xs）表示，均數(shù)間比較用t檢驗，采用Spss10.0統(tǒng)計軟件分析.2結果2.1細胞形態(tài)及MTT檢測隨著TNP-470濃度的增加，梭形Lovo細胞逐漸變小變園，間隙增寬，細胞內(nèi)顆粒增多，折光度下降，培養(yǎng)48h后未見細胞密度明顯增加，大部分細胞仍貼壁生長，少部分漂浮于培養(yǎng)液中.從Lovo細胞生長抑制率曲線可以看出，TNP-470的抑制作用存在量效倚賴關系，回歸分析得出72h的IC50為55.8gL-1（Fig1）.圖1略2.2腫瘤體積兩組裸鼠皮下移植瘤在移植12d后生長明顯，但TNP-470組腫瘤在20d后生長幾乎處于停滯狀態(tài)，體積未見明顯增加.最終對照組皮下瘤體積為（134538）mm3，TNP-470組為（73140）mm3，兩組腫瘤體積差異有顯著意義（P<；0.01），抑瘤率達45.6%（Fig2）.2.3TUNEL染色結果對照連續(xù)切片HE染色（Fig3A），鏡下凋亡細胞TUNEL染色表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色染色.陽性反應產(chǎn)物在凋亡細胞內(nèi)呈不均勻分布，近核膜處著色較深，核中央著色較淺，核固縮則染色質(zhì)呈塊狀集聚.有的細胞核固縮不明顯，整個細胞呈淺棕黃色，可能是細胞處于凋亡早期，未凋亡細胞的胞核為藍綠色（Fig3B）.治療組腫瘤細胞凋亡率為（21.42.1）%，對照組為（7.51.5）%，差異有顯著意義（P<；0.001）.圖2略3討論目前研究表明，血管生成是惡性腫瘤迅速生長、轉移、擴散的主要條件之一1.惡性腫瘤生長轉移的血管依賴性也提示:通過抑制腫瘤的血管生成可以有效的防治腫瘤的生長、浸潤和轉移2.結直腸癌是消化道常見腫瘤，自20世紀70年代以來，結直腸癌發(fā)病率在我國逐漸上升3.我們利用血管抑制劑TNP-470觀察其對實驗性結腸癌的治療效應.實驗表明，TNP-470對體外培養(yǎng)的人結腸癌Lovo細胞的生長有較強抑制作用，抑制作用呈量效依賴關系.Yakmamoto等4觀察到TNP-470可誘導5種乳腺癌細胞（MDA-MB-231，T-47D，MCF-7，KPL-1，MKL-F）凋亡，并檢測到促凋亡蛋白Bax，Bcl-xS表達明顯增加，凋亡抑制蛋白Bcl-2，Bcl-xL的表達顯著下降.動物實驗也表明，TNP-470抑制腫瘤生長的同時，腫瘤細胞凋亡顯著增加5，6.因此TNP-470的體內(nèi)抗瘤效應是通過抑制腫瘤血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡雙重作用實現(xiàn)的.我們采用TUNEL染色法檢測腫瘤組織中Lovo細胞的凋亡情況，鏡下觀察到TNP-470組有大量的腫瘤細胞核被染成棕黃色，凋亡細胞在腫瘤組織中彌散分布，而HE對照染色典型凋亡細胞較少，可能是部分細胞處于凋亡早期.我們結果表明，TNP-470對體內(nèi)外結腸癌Lovo細胞的生長有較強的抑制作用，該作用可能與TNP-470誘導Lovo細胞凋亡有關.實驗結果也提示:對于血管形成期的腫瘤，TNP-470可通過抗血管生成作用抑制腫瘤的生長和轉移.圖3略參考文獻:1LiuDH，ZhangXY，HuangXY，F(xiàn)anDM.Constructionofeu-karyoticexpressionvectorofVEGF165geneanditseffectononcogenesisofhumangastriccarcinomaJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2001；22（9）:813-816.2LiuDH，ZhangXY，HuangXY，F(xiàn)anDM.VEGF165antisensegeneandbiologicalcharacteristicsofhumangastriccancercellsJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2001；22（9）:821-824.3ShaoLN，LaiMD.MutagensensitivityincolorectalcancerJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；21（1）:72-75.4YamamotoD，KiyozukaY，AdachiY，TakadaH，HiokiK，TsuburaA.Synergisticactionofapoptosisinducedbyeicos-apentaenoicacidandTNP-470onhumanbreastcancercellsJ.BreastCancerResTreat，1999；55（2）:149-160.5TakeiH，LeeES，CisnerosA，JordanVC.Effectsofangiogen-esisinhibitorTNP-470ontamoxife