代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用概況.doc

代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用概況代謝組學(xué)是一門對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系，揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)，其研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。中醫(yī)證候是通過中醫(yī)四診獲取的基本信息，概括人體在病程中某一時(shí)間段的病理狀態(tài)。因此，通過祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)人體所處證候的分類研究，用代謝組學(xué)方法對(duì)生理病理信息進(jìn)行分析，認(rèn)識(shí)人體的狀態(tài)特征，從更深層次溝通中西醫(yī)兩種醫(yī)學(xué)體系，是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)學(xué)證候現(xiàn)代化的有效途徑之一。現(xiàn)將代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用概況論述如下。1代謝組學(xué)1.1概況國(guó)際“代謝組學(xué)之父”、英國(guó)帝國(guó)理工大學(xué)JeremyK.Nicholson教授基于長(zhǎng)期對(duì)生物體液的研究，于1999年提出了代謝組學(xué)的概念：定量測(cè)量生物系統(tǒng)對(duì)病生理刺激和基因修改所做的與時(shí)間相關(guān)的多參數(shù)代謝應(yīng)答1。從健康到病理改變，從體質(zhì)到證候，人體的代謝產(chǎn)物會(huì)隨之發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。所以，利用代謝組學(xué)研究人體代謝物組，可以用于疾病的診斷和中醫(yī)證候的判斷。1.2研究方法代謝組學(xué)的研究一般包括代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)記物識(shí)別和途徑分析等步驟。生物樣品(如尿液、血液和培養(yǎng)液等)采集后進(jìn)行生物反應(yīng)滅活、預(yù)處理。運(yùn)用核磁共振、質(zhì)譜或色譜等檢測(cè)其中代謝物的種類、含量、狀態(tài)及其變化，得到代謝譜或代謝指紋，再使用多變量數(shù)據(jù)分析方法對(duì)獲得的多維復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和信息挖掘，并研究相關(guān)代謝物變化涉及的代謝途徑和變化規(guī)律，以闡述生物體對(duì)相應(yīng)刺激的響應(yīng)機(jī)制、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物2。1.2.1生物樣本采集血漿或血清、尿液、糞便提取物、舌苔液、唾液，以及生物組織樣品等各種生物體液，都是代謝組學(xué)的生物樣本。王全軍等3研究Z24染毒大鼠血漿的代謝表型改變，及其與組織病理、血液生化指標(biāo)的相關(guān)性，探討代謝組學(xué)在藥物毒性早期篩選中的應(yīng)用。雷榮輝等4運(yùn)用代謝組學(xué)檢測(cè)納米銅染毒大鼠的血清代謝成分變化，結(jié)合常規(guī)血液生化和組織病理學(xué)檢查，尋找損害早期的代謝標(biāo)記物，揭示血液代謝表型變化與納米銅靶器官損害間的關(guān)系。王勇等5研究三聚氰胺對(duì)兒童尿液代謝的影響，闡明代謝組學(xué)能應(yīng)用于三聚氰胺導(dǎo)致的代謝異常研究，以及三聚氰胺導(dǎo)致腎損傷的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。1.2.2測(cè)定方法完成生物樣本采集后，需要對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。縱觀諸多文獻(xiàn)，色譜、質(zhì)譜（MS）、核磁共振譜（NMR）、紅外光譜、電化學(xué)檢測(cè)等都被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)的研究中。其中，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、NMR成為最主要的測(cè)定方法。黃強(qiáng)等6概括了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)中的廣泛應(yīng)用，分別介紹了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)(CE-MS)，以及基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理。危陽(yáng)洋等7基于核磁共振(NMR)代謝組學(xué)方法，研究甲亢患者和健康人群的血清和尿液特征代謝物。1.2.3多變量數(shù)據(jù)分析方法基于代謝組學(xué)得到的海量信息，主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、非線性映射（NLM）、聚類分析（HCA）、人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(ANN)等模式識(shí)別技術(shù)成為數(shù)據(jù)分析的主要應(yīng)用手段。其中，PCA和PLS-DA是代謝組學(xué)研究中常用的分析方法。2代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用中醫(yī)證候是一個(gè)復(fù)雜的生命現(xiàn)象。近年來(lái)孕育而生的代謝組學(xué)，能整體反映生物體功能水平，還能精細(xì)測(cè)量代謝產(chǎn)物。融入當(dāng)前系統(tǒng)生物學(xué)的學(xué)術(shù)內(nèi)涵對(duì)于中醫(yī)證候的本質(zhì)研究將是必然的趨勢(shì)。后基因組時(shí)代的到來(lái)，分子生物學(xué)作為現(xiàn)代生命科學(xué)的前沿學(xué)科，為中醫(yī)證候的本質(zhì)研究提供了新的研究思路和技術(shù)平臺(tái)。運(yùn)用代謝組學(xué)這一現(xiàn)代最新技術(shù)探討中醫(yī)證候的本質(zhì)內(nèi)涵，為從微觀解讀中醫(yī)證候的本質(zhì)提供了可能，更為中醫(yī)證候現(xiàn)代研究開辟嶄新的研究領(lǐng)域。因此，查閱了近10年來(lái)的相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)了以下代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用概況。2.1腎陽(yáng)虛證董飛俠等8選擇慢性腎病期患者60例(腎陽(yáng)虛者、非腎陽(yáng)虛者各30例)和體檢健康志愿者30例，運(yùn)用尿液代謝組學(xué)指紋譜方法進(jìn)行研究。結(jié)果觀察到慢性腎病期與正常樣本代謝模式差異非常顯著，建立的預(yù)測(cè)能力也很強(qiáng)。25個(gè)差異代謝物排序后，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品鑒定差異性物質(zhì)的關(guān)鍵代謝成分分別是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯等物質(zhì)，并且明確變化方向和代謝途徑，能很好區(qū)分腎陽(yáng)虛證與非腎陽(yáng)虛證的差異性。楊麗萍等9采用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎陽(yáng)虛模型動(dòng)物的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常組動(dòng)物，而用溫陽(yáng)中藥干預(yù)后，模型動(dòng)物的代謝譜回歸至正常范圍，呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的結(jié)果。2.2虛寒證徐斌等10觀察大鼠灌胃給予龍膽水煎劑(RGD)后其尿液代謝譜變化及其與龍膽寒性作用的相關(guān)性。測(cè)定大鼠尿樣的核磁共振氫譜(1HNMR)數(shù)據(jù)表明，RGD組與對(duì)照組在主成分分析得分圖中呈聚類型分布，兩組間未見重疊。RGD組尿樣中葡萄糖、氨基酸等明顯增加，牛磺酸、氮氧三甲胺等明顯減少。長(zhǎng)時(shí)間給予較大劑量RGD可使大鼠出現(xiàn)虛寒證體征，給藥后尿液1HNMR譜變化與龍膽寒性作用相關(guān)。2.3寒證與熱證汪江山等11采用基于超高效液相色譜-時(shí)間飛行質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF)的血漿代謝組學(xué)方法，分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的疾病分型。結(jié)果可明顯區(qū)分RA的不同病程(穩(wěn)定期與活動(dòng)期)和中醫(yī)特定證候(寒證與熱證)等疾病亞型。因此，代謝組學(xué)在闡明傳統(tǒng)中醫(yī)理論，促進(jìn)中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的交流上有著廣泛的應(yīng)用前景。2.4血熱證劉衛(wèi)紅等12采用核磁共振譜儀技術(shù)，分析53例銀屑病血熱證治療前后及31例健康志愿者血漿代謝產(chǎn)物譜的差異。結(jié)果顯示銀屑病血熱證患者與健康對(duì)照組能被明顯區(qū)分，銀屑病血熱證治療前后也能較好分開。涼血解毒湯能調(diào)節(jié)銀屑病血熱證患者的糖脂類代謝，使其代謝網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)向正常狀態(tài)修復(fù)的趨勢(shì)。所以，代謝組學(xué)方法能較全面反映生物體的生理病理及代謝狀態(tài)，并可應(yīng)用于藥效評(píng)價(jià)研究。2.5肝火亢盛證、痰濕雍盛證及陰虛陽(yáng)亢證陸益紅等13探討原發(fā)性高血壓辨證分型與基于GC/MS血清代謝組學(xué)的關(guān)系。應(yīng)用GC/MS測(cè)定健康人及原發(fā)性高血壓病人血清內(nèi)源性代謝物，分析他們的代謝譜后表明健康人與高血壓病人血清代謝譜有明顯差異，上述三種證型的高血壓可被清晰區(qū)分，高血壓的發(fā)展過程也可顯示?？梢?，基于GC/MS和模式識(shí)別的代謝組學(xué)技術(shù)在揭示傳統(tǒng)中醫(yī)理論本質(zhì)上有著廣泛的應(yīng)用前景，不失為探尋證候物質(zhì)基礎(chǔ)的較適宜手段。2.6肝郁脾虛證等14探討慢性束縛應(yīng)激大鼠（肝郁脾虛模型）的血漿代謝表型改變。經(jīng)過對(duì)慢性束縛應(yīng)激大鼠血漿1HNMR譜的分析，表明各組大鼠血漿1HNMR代謝譜之間存在差異，而且可能從代謝組學(xué)分析中找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物，闡釋中醫(yī)肝郁脾虛證候的生物學(xué)本質(zhì)，探討代謝組學(xué)在中醫(yī)證候?qū)W研究中的應(yīng)用。因此，代謝組學(xué)分析是一種有良好發(fā)展前景的中醫(yī)證候?qū)W研究方法。2.7痰瘀證劉衛(wèi)紅等15探討痰瘀證候的動(dòng)態(tài)演變、時(shí)相特點(diǎn)和由痰致瘀在代謝方面的變化。分析高脂血癥模型大鼠血漿1HNMR譜，顯示各組大鼠代謝譜各不相同。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，不同時(shí)點(diǎn)模型組大鼠的代謝譜亦各不相同，表明高脂血癥前期以脂質(zhì)代謝紊亂為特點(diǎn)，隨著病程進(jìn)展，參與血液凝固過程的乙酰糖蛋白出現(xiàn)，說明凝血機(jī)制出現(xiàn)異常，同時(shí)酮體及乳酸的升高說明脂質(zhì)代謝紊亂進(jìn)一步加重。所以，可能從代謝組學(xué)分析中找出痰瘀演變過程特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物，以闡釋中醫(yī)痰瘀證候的生物學(xué)本質(zhì)。2.8痰阻心脈證、氣陰兩虛證王廣基等16基于GC-TOF/MS代謝組學(xué)方法，對(duì)痰阻心脈和氣陰兩虛型冠心病患者血漿中小分子化合物進(jìn)行全面檢測(cè)，以探索血漿內(nèi)源性化合物的差異。結(jié)果表明代謝組學(xué)方法可區(qū)別這兩證型冠心病，還可以與健康組明顯區(qū)分。而且，這兩證型間多個(gè)內(nèi)源性代謝物的含量存在明顯差異，并與能量、氨基酸和核苷酸代謝異常相關(guān)?？梢?，代謝組學(xué)的整體數(shù)據(jù)和標(biāo)志物信息均顯示出痰阻心脈和氣陰兩虛型冠心病的差異，提示代謝組學(xué)所研究的體內(nèi)小分子化合物可能正是中醫(yī)分型的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.9氣虛血瘀證李林等17利用核磁共振氫譜方法研究氣虛血瘀證大鼠對(duì)比于正常大鼠尿液的組成變化，發(fā)現(xiàn)病變大鼠尿液中甲酸、肌氨酸酐、-酮戊二酸、檸檬酸等成分含量發(fā)生了變化，為進(jìn)一步提示氣虛血瘀證的產(chǎn)生機(jī)制和病癥治療提供了證據(jù)。此外，用GC-MS方法研究慢性心肌缺血屬于氣虛血瘀證的小型豬血漿樣本發(fā)現(xiàn)18，脂質(zhì)代謝物如甘油、醋酸等，肌醇，氨基酸和脯氨酸的代謝水平明顯提高，而葡萄糖、氨基酸和脂質(zhì)代謝物的含量大幅下降?？梢?，這個(gè)代謝模式可用于臨床診斷和治療慢性心肌缺血，也可為中醫(yī)氣虛血瘀證的研究提供新思路。2.10濕證本課題組中醫(yī)濕證的代謝研究，如：慢性腎衰中醫(yī)濕證的尿液代謝組學(xué)研究、慢性胃炎中醫(yī)濕證的舌苔液代謝組學(xué)研究等都是采用了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行了研究，并得出了相應(yīng)的代謝產(chǎn)物?；谝陨细鞣N代謝組學(xué)方法對(duì)于中醫(yī)證候的本質(zhì)研究，總結(jié)其優(yōu)缺點(diǎn)如下。核磁共振譜（NMR）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是中醫(yī)證候本質(zhì)研究的兩種常用方法。核磁共振譜方法，很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分，核磁共振氫譜(1HNMR譜)最為常用。NMR法極具實(shí)用性，對(duì)生物樣品的預(yù)處理快速又簡(jiǎn)便；可檢測(cè)整體動(dòng)物或人體特定器官細(xì)胞內(nèi)的代謝物組而無(wú)損傷性。但其缺點(diǎn)是靈敏度較低。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，如GC-MS、超高效液相色譜-時(shí)間飛行質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF)、GC-TOF/MS等都被應(yīng)用于中醫(yī)證候的本質(zhì)研究。對(duì)生物樣本內(nèi)復(fù)雜代謝物中的多種成分進(jìn)行定性和定量分析，無(wú)偏性、高效快速、靈敏度高。不過，每種色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)都有其不足之處。GC-MS預(yù)處理過程較繁瑣，衍生化方法復(fù)雜，GC分離效率不高；LC-MS缺少譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，難以鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；GC-TOF/MS的數(shù)據(jù)處理甚為復(fù)雜，不易靈活運(yùn)用。3目前存在的問題代謝組學(xué)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究中的應(yīng)用廣泛，并取得了一定的研究成果。目前，基于代謝組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)證候本質(zhì)研究方面依然存在一些不足之處。中醫(yī)證候本質(zhì)的代謝組學(xué)研究平臺(tái)尚不完備。由于代謝組學(xué)研究的儀器設(shè)備成本較大，研究單位難以有足夠的資金加以引進(jìn)來(lái)研究。中醫(yī)證候的臨床研究病例數(shù)偏少，代謝組學(xué)結(jié)果難以與臨床病證相銜接，不能很好進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。代謝組學(xué)研究中醫(yī)證候本質(zhì)的背景資料積累很少，難以建立數(shù)學(xué)模型。要進(jìn)行有意義的中醫(yī)證候代謝組學(xué)研究，必須有大量正常生理狀態(tài)的研究基礎(chǔ)作為背景資料，從而運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)解決數(shù)學(xué)建模。代謝組學(xué)研究的影響因素很多，各項(xiàng)中醫(yī)證候臨床質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)(如飲食、年齡等)不均衡，不能保證研究結(jié)果的可重復(fù)性。各種組學(xué)數(shù)據(jù)的不對(duì)接，得出的結(jié)果會(huì)有片面性，不能全面說明中醫(yī)證候的本質(zhì)。4未來(lái)展望和思考運(yùn)用代謝組學(xué)研究中醫(yī)證候的本質(zhì)，有著無(wú)限發(fā)展的空間。完善代謝組學(xué)的研究平臺(tái)；臨床研究中要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以加大說服力；注重代謝組學(xué)背景資料的積累，為數(shù)學(xué)建模做鋪墊；盡量控制中醫(yī)臨床數(shù)據(jù)采集的影響因素；綜合分析基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)的共同數(shù)據(jù)，加強(qiáng)多學(xué)科交叉融合，降低研究成本強(qiáng)調(diào)中醫(yī)基礎(chǔ)理論的支撐作用，完善代謝組學(xué)的研究技術(shù)，避免理論研究與臨床實(shí)踐脫節(jié)，提高中醫(yī)證候研究的可操作性和數(shù)據(jù)分析的針對(duì)性。采用代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)與方法進(jìn)行中醫(yī)證候研究，有望在中醫(yī)藥領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床實(shí)踐，充分借助現(xiàn)代技術(shù)，采用現(xiàn)代語(yǔ)言闡釋中醫(yī)獨(dú)特的思維方式和治療方法，這是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)證候本質(zhì)研究的必由之路。相信隨著人力和物力的不斷投入，以及應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證候本質(zhì)研究必將在未來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍。代謝組學(xué)實(shí)質(zhì)上是采用系統(tǒng)生物學(xué)思路進(jìn)行研究代謝小分子組的一種高通量分析方法，通過比較不同條件下的小分子代謝譜的異同，在醫(yī)學(xué)上用于診斷、毒理和藥理研究，并且通過對(duì)小分子代謝譜的全面定性、定量分析19，可有效找到生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志模式。運(yùn)用代謝組學(xué)進(jìn)行中醫(yī)證候的本質(zhì)研究，為中醫(yī)證候客觀化研究提供了新的思路和線索，更為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化開辟新的方向。隨著當(dāng)代生物科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，中醫(yī)證候本質(zhì)的現(xiàn)代化研究正面臨借鑒新觀念和新技術(shù)，尋找合適的切入點(diǎn)，來(lái)促進(jìn)自身發(fā)展的機(jī)遇。代謝組學(xué)將為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供一種非常有用的技術(shù)手段?？傊?，代謝組學(xué)是一門前沿性科學(xué)，研究方法多種多樣。中醫(yī)證候的本質(zhì)研究，有無(wú)限的挖掘空間?；诖x組學(xué)來(lái)研究中醫(yī)的諸多證候本質(zhì)，已初步顯現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。雖然目前還存在一些地方需要改進(jìn)，但隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，代謝組學(xué)勢(shì)必將對(duì)