（微生物學專業(yè)論文）鹽藻64光裂合酶基因的功能鑒定及表達研究.pdf

“ 、 f q 四川大學碩士學位論文 四j h 大學碩士學位論文 的修復活性，能使s y 2 的存活率提高約1 1 倍：高強度的紫外線( 0 5 j m 2 ) 造 成的損傷過于嚴重對生物體是強致死的，菌落存活率都已降到1 0 - 2 以下，c p d 光裂合酶和6 4 光裂合酶難以在短時間內對其加以修復；同時從實驗的角度證 明了d s 6 4 p h r 屬于6 - 4 光裂合酶基因而非c p d 光裂合酶基因。 2 、完成了d s 6 4 p h r 基因的原核表達、純化以及條件的優(yōu)化。構建 p e l 3 0 a - d s 6 4 p h r 表達載體；將其轉入ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 進行融合蛋白的表 達；通過洗滌包涵體的辦法純化d s 6 4 p h r 融合蛋白 實驗確立使用t y p g 培養(yǎng)基，在l m m o l l 的i p t g 終濃度下3 7 c 誘導表達 4 h ：通過s d s - - p a g e 分析證實產物大小為7 3 k d ，與耳的蛋白大小相符：目的 蛋白僅僅以不溶性的包涵體形式出現(xiàn)在細胞破碎后的沉淀重懸液中；最終通過 緩沖液洗滌包涵體得到純凈的目的蛋白。 3 、制備了d s 6 4 p h r 的多克隆抗體。采用皮下多點注射方法，用純化的日 的蛋白做抗原免疫兔子制備目的蛋白特異性的多克隆抗體。 通過雙向免疫擴散法實驗測定效價為1 ：3 2 ，特異性好；達到w e s t e r n 雜交 實驗對多克隆抗體效價及特異性的要求。 4 、研究了d s 6 4 p h r 在不同條件下的m r n a 和蛋白質的表達特性。通過 n o r t h e r n 和w e s t e r n 雜交實驗，選擇光照培養(yǎng)時間、紫外照射強度、黑暗條件誘 導及商鹽環(huán)境脅迫為實驗條件，以時間的變化為實驗參數(shù)，研究目的基因在r n a 水平及蛋白質水平上表達量的差異性。 實驗結果顯示光照條件對r n a 及蛋白的表達量都具有一定的誘導作用，并 都在8 h 時達到最高值；而紫外照射及長時間的黑暗培養(yǎng)對表達的誘導情況不明 顯；高鹽脅迫環(huán)境下，隨著誘導時間的變化，基因的表達量差異明顯，從2 h 開 始蛋白表達量呈增加趨勢，到2 4 h 開始遞減，整個過程呈由增到減的變化趨勢； 同時發(fā)現(xiàn)d s 6 4 p h r 的表達情況及表達水平特性有別于其他物種的光裂合酶基 因。 關鍵詞：鹽生杜氏藻紫外線6 - 4 光裂合酶光產物 2 四川大學碩士學位論文 t h ef u n c t i o nc h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o nr e s e a r c ho ft h e 6 - 4p h o t o l y a s eg e n ed s 6 4 p h rf r o md u n a l i e l l as a l i n a m a j o r m i c r o b i o l o g y g r a d u a t e1 3o i a na d v i s o rc a oy i t h ei r r a d i a r i a no fu l t r a v i o l e tc a l li n d u c eo x i d i z e d - l e s i o n sl i k el e t h a lp y r i m i d i n e d i m e r si no r g a n i s mg e n o m e s o n es i g n i f i c a n tl e s i o ni st h e6 - 4p y r i m i d i n ep y r i m i d o n e p h o t o p r o d u c t ( 6 - 4p p ) i td i r e c t l yc a u s e sa p o p t o s i s ，t h u sar e m a r k a b l e i n d u c e ro f m u t a t i o na n dc e l ld e a t h o nt h eo t h e rh a n d ，c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m m e r ( c p d ) i u s th a sa l le f f e c to fc c l lc y c l ea r r e s t t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ha n du t i l i z a t i o no ft h e6 - 4 p h o t o l y a s eg e n ei so f p r e d o m i n a n ts i g n i f i c a n c e d u n a l i e l l as a l i n ai sas a l t - t o l e r a n tu n i c e l l u l a rg r e e na l g aw h i c hc a ns u r v i v e e x t r e m es a l t ye n v i r o n m e n ta n dp o s s e s s e sc o m p a r a t i v et o l e r a n c ea g a i n s tu v w eh a dr e p o r t e dt h a tt h e6 - 4p h o t o l y a s eg e n ed s 6 4 p h ro fd u n a l i e l l as a l i n a h a d b e e ns u c c e s s f u l l yc l o n e df o rt h ef i r s tt i m e o nt h a tg r o u n d w o r k , w ed i das e r i e s o fr e s e a r c ho nt h i sg e n ef o c u s i n go np r o p e r t i e so fl e s i o n - r e p a i rp e r f o r m e db yt h e g e n ep r o d u c t6 - 4p h o t o l y 鵪ca n dg e n ee x p r e s s i o na t t h el e v e lo fn u c l e i ca c i da n d p r o t e i n 1 、t h ef u n c t i o no ft h eg e n ed s 6 4 p h rw a si d e n t i f i e d 訪v i v at h r o u g h c o m p l e m e n t a r ye x p e r i m e n t t os t u d y i t sa n t i u vp r o p e r t i e s 。d s 6 4 p h rw a s t r a n s f o r m e di n t ot h ec p d - d e f e c t i v es t r a i ns y 2 t h eg e n eo fc p dp h o t o l y a s ew a s 3 四川大學碩士學位論文 t r a n s f o r m e di n t os y 2c o n s t r u c t i n gas t r a i na sp o s i t i v ec o n t r o lc o m p a r e dw i t ht h e s t r a i nc o n t a i n i n gd s 6 4 p h r ；s y 2c o n t a i n i n go n l yp e t 3 2 aa s n e g a t i v ec o n t r o l r e f l e c t i n gt h ee x c l u s i v ee f f e c to fd s 6 4 p h r a c c o r d i n gt ot h ed a t aa c q u i r e d , w e c o n c l u d e dt h a p h o t o r e a c t i v a t i o ns h o u l da c c o u n tf o rt h er a i s eo fs u r v i v a lr a t eo ft h e p h o t o l y a s e - e x p r e s s i n gs t r a i n ；t h e6 - 4p h o t o l y a s ec o u l dr e p a i rt h eu v - s c a t h e dc e l l ， r a i s i n gt h es u r v i v a lr a t ea b o u to n et i m e ；ec o l i p h o t o l y a s ep o s s e s sg r e a t e ra c t i v i t i e s i n r e p a i r i n gu v - i n d u c e d l e s i o n sc o m p a r e dw i t h6 - 4p h o t o l y a s ed e r i v e df r o m d s 6 4 p h rw i t hw h i c ht h es u r v i v a lr a t eo fs y 2w e r ea p p r o x i m a t e l y l lt i m e so ft h e p e t 3 2 as t r a i n ；s e v e r el e s i o n si n d u c e db yi n t e n s eu vl i g h t ( o 5 j m 2 ) c o u l dn o tb e r e v e r s e db yb o t he n z y m e sa tt h em o m e n ta st h es u r v i v a lr a t ed e c l i n e dt ob e l o w1 0 - 2 ； a n dd s 6 4 p h rw a se x p e r i m e n t a l l yp r o v e dt ob ea6 4p h o t o l y a s eg e n er a t h e rt h a na c p d p h o t o l y a s eg e n e 2 、t h ep r o k a r y o t i ce x p r e 豁i o no fd s 6 4 p h ra n dt h ep u r i f i c a t i o no ft h ef u s i o n p r o t e i ni n c l u d i n gc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n w e r e a c c o m p l i s h e d v e c t o rp e t 3 0 a d s 6 4 p h r w a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o r m e d i n t o ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) t o o v e r e x p r e s s t h e f u s i o np r o t e i nd e f t v e df r o md s 6 4 p h r ；i n c l u s i o n b o d i e sw e r ew a s h e dt h e nt h e f u s i o np r o t e i n sa c q u i r e d t y _ p gm e d i u mw a su t i l i z e d c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h 口t gf o r4 ha t3 7 。ct os u f f i c i e n t l ye x p r e s st h ep r o t e i n t h e ns d s p a g ea n a l y s i s w a sp e r f o r m e da n dt h eo u t c o m ei n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nw a s7 3 k d w h i c hw a s c o n s i s t e n tw i t ha n t i c i p a t i o n h o w e v e r , p r o t e i n se x p r e s s e dr e m a i n e di nt h ef o r mo f i n c l u s i o n b o d i e si nt h er e - s u s p e n d e ds o l u t i o na f t e ru l t r a s o n i cd i s r u p t i o n w ew a s h e d t h ei n c l n s i o n b o d i e sw i t hr e l e v a n tb u f f e rt h e na c q u i r e dt h ef u s i o n p r o t e i nw i t h r e q u i r e dp u r i t y 3 、t h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e s ( p c a b ) a g a i n s tt h ep r o t e i nd e r i v e df r o md s 6 4 p h r w c r ea c q u i r e d r a b b i t sw e r em u l t i s u b c u t a n e o u l yi n j e c t e dt op r o d u c et h ef u s i o n p r o t e i n - s p e c i f i ca n t i b o d i e s p r o t e i n sa c q u i r e dt h r o u g hp u r i f i c a t i o nw e r eu t i l i z e da s a n t i g e n s t h et i t e ro fp c a bd e t e c t e db yd o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s tw a s1 ：3 2t h u s c o u l db eu t i l i z e di nw e s t e r n b l o t t i n g 4 、c o n c e r n i n ga b o u t t h i sg e n e ( d s 6 4 p h r ) ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm r n a 4 四川大學碩士學位論文 p r o d u c ea n dp r o t e i ne x p r e s s i o nu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e d g e n e e x p r e s s i o nw a si 略p c c 把da tt h el e v e l so fm r n a a n dp r o t e i na f t e rd i f f e r e n tt i m eb y n o r t h e r nb l o t t i n ga n dw e s t e r nb l o t t i n g l r i a b i 媯i n c l u d e dl i g h t - i n c u b a t i n gt i m e u vi r r a d i a t i o ni n t e n s i t y , d a r k - i n c u b a t i o na n ds e v e r es a l t - s t r e s s t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tl i g h ti n c u b a t i o ne x e r t e da l l i n d u c i n ge f f e c to nt h ep r o d u c t i o no fm r n a a n d p r o t e i n , b o t h o fw h i c hr e a c h e dt h e i rc u l m i n a t i o na f t e r8 h ；n e v e r t h e l e s s u v i r r a d i a t i o na n dd a r k - i n c u b a t i o nh a dn oa p p a r e n te f f e c to nt h a t ；u n d e re n v i r o n m e n t o f s e v e r es a l t s t r e s s ，t h ee x p r e s s i o no fg e n ev a r i e dal o ta st h ei n d u c i n gt i m ew a s c h a n g i n g , s a y , t h eq u a n t i t yo fp r o t e i n sb e g a nt or i s ea f t e r2 h ，a n dg r a d u a l l yd e c l i n e d a f t e r2 4 h ；s o m ed i f f e r e n c e si ne x p r e s s i o nb e t w e e nd s 6 4 p h ra n dp h o t o l y a s eg e n e f r o mo t h e rs p e c i e sh a da l s ob e e nf o u n d k e y w o r d ：d u n a l i e l l a 陽砌口，u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，6 - 4p h o t o l y a s e ，p h o t o p r o d u c t 5 四川大學碩士學位論文 目光中的紫外線( i r e ，2 0 0 3 0 0 n m ) 是環(huán)境中一個主要的誘變劑和致癌物， 由它引發(fā)的d n a 光損傷與許多疾病相關，如：癌癥、著色性干皮病，毛發(fā)硫營 養(yǎng)不良、科凱恩氏綜合征。 生物細胞受紫外光照射會導致基因的嚴重損傷。其中最主要的兩種損傷產 物分別為環(huán)丁烷嘧啶二聚體( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m m e r ，c p d ) 和6 _ 4 光產 物( 6 4p y r i m i d i n ed i m m e r 或6 - 4p h o t o p r o d u c t ) 。這兩種損傷分別構成u v 光產 物的7 0 8 0 和2 0 3 0 。它們分別由兩種光裂合酶進行修復：c p d 特異性的 c p d 光裂合酶和6 - 4 光產物特異性的6 - 4 光裂合酶。 現(xiàn)有大量文獻報道c p d 光裂合酶對c p d 光產物的修復，但是關于6 4 光裂 合酶修復過程的解釋仍然處于假說階段1 1 8 】，大家各抒己見，未能得到統(tǒng)一的答 案。6 - 4 光產物雖然只占整個細胞d n a 紫外損傷的2 0 - - 3 0 ，但它比c p d 光產 物更具有致突變性，并且它的存在很多時候對細胞是致死性的，因為它能引起 細胞的凋亡，而c p d 光產物僅僅造成細胞周期暫時或短期的停滯現(xiàn)象。 在很多有機體包括人和ec o i l 中，由于缺乏6 - 4 光裂合酶，光復活光線并 不能消除d n a 中的6 - 4 光產物?，F(xiàn)在已有文獻報道【2 】，將6 - 4 光裂合酶轉入小 鼠細胞核，使其表達6 4 光裂合酶基因的抗紫外修復能力，能夠明顯的降低小 鼠細胞癌變幾率，減少小鼠個體在紫外環(huán)境下的病變可能性。因此，可以大力 開發(fā)研究6 4 光裂合酶基因產物，嘗試進行基因治療人類由于紫外損傷造成的 皮膚疾??；甚至將其運用到化妝品領域，增強人類抗紫外損傷的能力。 目前世界上已經成功克隆得到的完整的6 - 4 光裂合酶基因不超過l o 條，并 且基本上都是從動物或高等植物中得到的，具體的物種為擬南芥1 1 6 1 、響尾蛇、 鮐類、果蠅和非洲爪蟾【”j 鹽生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 作為一種耐鹽性極強的真核單細胞綠藻， 隸屬綠藻綱、團藻目，杜氏藻科。它廣泛的分布在各種極端惡劣的環(huán)境中，能 在高鹽溶液中生存【3 l 并能耐受外界鹽濃度的劇烈變化，它還能適應大幅度的溫 度變化，高靜水壓，高強光照射及某些殺蟲劑和重金屬【4 1 。鹽藻明顯的耐強光 6 四川大學碩士學位論文 性，推測它具有一定的抗紫外能力。 2 0 0 3 年，本實驗室成功的克隆到鹽藻6 - 4 光裂合酶( 歷鰣尸團) 的全長基 因，并對其作了全面的生物信息學分析d s 6 4 p h r 是目前為止人類從單細胞真 核生物中克隆得到的第一條6 _ 4 光裂合酶基因，而鹽藻作為實驗材料以研究6 _ 4 光裂合酶光修復分子機制具有明顯的優(yōu)勢性 普通的大腸桿菌含有c p d 光裂合酶基因，在受到外界紫外損傷后，可通過 光誘導進行損傷后的修復。實驗室由日本京都大學p r o f s h i n j iy a s u h i r a 贈予獲 得了ec o l ic p d 缺陷型菌株s y 2 。使用s y 2 作為宿主菌，光修復效應只能來自 轉入載體所表達的外源基因，實驗過程有效的去除了c p d 光裂合酶基因作用的 干擾，是獨立研究6 - 4 光裂合酶基因性質的理想材料。 在之前的研究工作中，還沒有人將6 _ 4 光裂合酶基因的修復特性做得很細 致，更沒有做過表達情況及表達水平的詳盡探究，d s 6 4 p h r 的來源更不同于之 前克隆得到的幾條6 4 光裂合酶基因。綜上所述，本論文的具體實驗設計如下： 1 、構建載體將d s 6 4 p h r 轉入ec o l is y 2 中進行功能互補實驗，鑒定 d s 6 4 p h r 的抗紫外功能； 2 、將ec o l ic p d 光裂合酶基因和不含光裂合酶基因的空載體p e t 3 2 分別 轉入s y 2 中作為實驗對照，比較d s 6 4 p h r 及大腸桿菌c p d 光裂合酶的修復活 性并研究d s 6 4 p h r 的修復特性； 3 、進行目的基因的ec o l i 原核表達，確立誘導培養(yǎng)的最適條件，并純化得 到d s 自 p 職目的蛋白； 4 、利用純化蛋白制備特異性多克隆抗體； 5 、通過n o r t h e r n 和w e s t e r n 雜交實驗研究基因的表達情況，以鑒定d s 6 4 p h r 在表達情況及表達水平上與其他光裂合酶基因的差異。 本論文工作的開展為我們更好的認識d s 6 4 p h r ，對整個6 _ 4 光裂合酶修復 機理的研究與分析、對闡明6 4 光裂合酶自身特性起到了相當重要的輔助作用， 甚至對整個光裂合酶藍光受體家族來說都具有很深遠的意義。同時還為更加全 面的了解鹽藻這一單細胞模式生物開辟了新的道路和研究方向。 7 四川大學碩士學位論文 論文 第一章應用大腸桿菌c p d 缺陷株s y 2 驗證d $ 6 4 p h r 基因功能 鹽生杜氏藻( d u n a l m l as a l i n a ) 昏4 光裂合酶基因d s 6 4 p h r ，是人類目前 從單細胞生物中克隆得到的第條的6 - 4 光裂合酶基因，填補了g e n b a n k 光裂 合酶注冊基因在藻類方面的空白。 本章實驗設計利用p e t 3 2 a 載體將d s 6 4 p h r 轉入ec o l i ，誘導表達6 4 光 裂合酶，進行該基因的體內功能驗證。野生型的ec o l i 含有c p d 光裂合酶基因， 如果選取普通的野生型ec o l i 作為宿主菌進行功能鑒定實驗，勢必對6 4 光裂 合酶基因的修復效果產生干擾。故實驗選取了ec o l i c t d 光裂合酶缺陷型菌株 s y 2 作為6 4 光裂合酶基因的宿主菌，s y 2 是ec o l ij m l 0 7 的突變株，在基因 組d n a 上人為的缺失了c p d 光裂合酶基因。作為獨立研究6 - 4 光裂合酶基因 的紫外損傷修復功能，s y 2 是理想的實驗材料。 實驗過程中，分別將p e t 3 2 a 空載和攜帶ec o l ic p d 光裂合酶基因的 p e t 3 2 a 載體轉入s y 2 ，作為對照樣本，對d s 6 4 p h r 的修復特性進行更深層次 的研究與分析功能驗證實驗具體分為三大部分，第一部分固定紫外照射強度， 選用可見光修復與否作為變量；第二部分改變紫外照射強度，研究存活率變化 情況；第三部分選用可見光修復時間作為變量，分析其對菌落存活率的影響。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌種、載體 ec o l ic p d 光裂合酶缺陷型菌株s y 2 由日本京都大學p r o f s h i n j iy a s u h i r a 贈予1 5 】： 表達載體p e l 3 2 a 由本實驗室保存。 8 四川大學硬士學位論文 l _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 。_ _ _ - _ 。_ _ - o o 。o 。_ 。1 。- 。_ _ - _ 。- _ 。_ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ - 一 1 1 2 基因 鹽藻6 - 4 光裂合酶基因d s 6 4 p h r 由本實驗室從鹽生杜氏藻( d u n a l i e l l a s a l i n a ) 中克隆得到【6 j 1 1 3 試劑 1 0 0 m m o l l i f r g 溶液、1 0 m g 砌r n a 酶溶液、1 0 0 m g m l 氨芐青霉素( a m p ) 溶液- - 2 0 * ( ：下貯存，試劑配方參見分子克隆實驗指南第三版附錄門； 質粒提取試劑嘲 1 、溶液i 葡萄糖5 0 m m o l i t r i s h c i ( p h 8 0 ) 2 5 m m o l l 星旦墜fp h 8 ：q 2! 虹現(xiàn)q ! 凰 1 2 1 c 滅菌1 5 r a i n ，4 。c 貯存 2 、溶液 n a o h 0 2 m o l l s 旦s! 綏 用前新鮮配制 3 、溶液 k a c ( s t o o l l )6 0 r a l 冰乙酸1 1 5 m l 去離王盔 至! q 陋1 4 ，酚氯仿抽提液 酚與氯仿以i - 1 體積混勻，靜置分層，4 0 c 下貯存，使用時取下層液體 5 、t e 緩沖液( p h 8 o ) i r i s h c i ( p h 8 o ) 1 0 m m o l i 墾q 互| 地叢：91 也也q 坦 1 2 1 c 滅菌2 0 r a i n ，4 c 貯存 9 四川大學碩士學位論文 核酸電泳試劑 1 、5 t b b t r i s 5 4 9 硼酸 2 7 5 9 e d t a ( 0 5 m o l l )2 0 m l ( p h ：8 m 去富王丞鹽至l l 2 、0 7 瓊脂糖凝膠 0 1 4 9 瓊脂糖，加入2 0 m l0 5 x t b e 緩沖液，加熱至完全熔化， 稍冷加入1 陬ll m g m le b ( 終濃度為0 5 x g m 1 ) ，振蕩混勻。 1 1 4 酶制劑、試劑盒 b a m h i ，h i n d ，t 4 連接酶，購自寶生物( t a k a r a ) 工程有限公司； e x t a q t mp c rk i t ，t a 克隆試劑盒購自寶生物( t a k a r a ) 工程有限公司： 膠回收試劑盒購自美國o m e g a b i o - t e k 公司。 1 1 5 引物及測序 引物的合成及測序工作由上海i n v i t r o g e n 公司完成。 1 i 6 培養(yǎng)基 1 、l b 培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 0 9 酵母提取物 5 9 n a a l o g 去直王丞籩q 瓔l 調節(jié)p h 到7 o ，高水定容至1 l ，1 2 1 c 濕熱滅菌2 0 r a i n 濕熱滅菌f 筘每l 液體培養(yǎng)基中加入1 5 9 瓊脂粉制成固體l b 培養(yǎng)基； 2 、s o b 培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 2 0 9 酵母提取物 5 9 四川大學硬士學位論文 n a a 0 5 9 k a ( 2 5 0 m m o l l ) 1 0 m l 去離王丞 2 5 q 堡l 調p h 至7 o ，高水定容至1 l ，1 2 1 。c 濕熱滅菌2 0 m i n 使用前加入5 m l2 m o f l m g c l 2 滅菌溶液： 3 、s o c 培養(yǎng)基 在滅菌待用的s o b 培養(yǎng)基中加入葡萄糖( 0 2 跏m 濾膜過濾除菌) ，終濃度 達到2 0 m m o l l 。 1 1 7 實驗儀器設備 紫外光源：超凈臺用2 0 w2 5 3 7 n m 紫外滅菌燈，照射強度為0 0 5 j ( m 2 。s 1 ； 可見光源：超凈臺用日光燈4 0 w ： 血球計數(shù)板( o 1 m m ，1 4 0 0 r a m 2 ) ，精確秒表。 1 2 方法 1 2 1 最c o l ic p d 光裂舍酶基因的克隆 p c r 反應 1 、根據g e n b a n k 公布的ec o l ic p d 光裂合酶基因序列設計p c r 引物 a n t i s e n s e ：5 一c c a a g ( 1 tg g c g t g t a i ：a g g a c r g g t - 3 s f n s e ：5 一c gg g a t c c 肖t g a c l a c c c a t c i g g l b 3 2 、使用菌液p c r 法，ec o l i j m l 0 9 為模板進行基因克隆 反應體系： 雙水3 3 缸l p c rb u f f e r 0 0 x ) 5 l m g c l 2 ( 2 5 r e t o o l l ) 3 “l(fā) d m p ( 2 5 m m o f l ) 4 “l(fā) 5 ，弓j 物( 2 毗m )m i 3 引物( 2 印m )恥l e xt a q ( 5 m u 0o 5 “l(fā) l l 四川大學碩士學位論文 苴遺叢! t 0 t a i 5 毗l 反應條件： 9 4 c 預變性5 m i n 9 4 c 變性3 0 s e c1 5 6 c 退火6 0 s e c - 3 0 個循環(huán) 7 2 c 延伸1 5 0 s e c j 7 2 c 延伸1 0 r a i n 3 、p c r 產物使用1 的瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢進行膠回收以得到ec o l i c p d 光裂合酶基因。 核酸膠回收 1 、切下凝膠放入1 5 m le p 管，加入等體積的b i n d i n gb u f f e r ，5 5 6 0 。c 溫 浴7 r a i n ，每隔2 3 m i n 輕搖1 次，直至凝膠完全溶解； 2 、取7 0 0 a 到提純柱，1 0 0 0 0 9 離心l o m i n ，再加3 0 0 ”1b i n d i n gb u f f e r 洗 柱，1 0 0 0 0 9 離心l m i n ： 3 、取s p w 和酒精的混合液7 0 0 u l ( s p w ：酒精= l ：4 ) 加入提純柱，放置2 3 m i n ，1 0 0 0 0 9 離心1 m i l l ： 4 、重復步驟3 ； 5 、去廢液，空管1 0 0 0 0 9 離心l m i n ； 6 、將提純柱轉移到1 5 m le p 管上，加入3 0 5 0 , ld n a 沈脫液，1 0 0 0 0 9 離心i m i n ，分2 次離心 含有目的核酸的離心管底部洗脫液，用于之后的t a 克隆反應。 t a 克隆 p m d1 8 一tv e c t o r s o l u t i o ni d n a ( 7 0 n g 肛1 )萎) 1 6 c 她3 0 r a i n 兩it o t a l 四川大學碩士學位論文 t a 克隆反應得到的產物經轉化后，進行測序。 ， 將所得序列進行b l a s t 比對分析，以確定克隆基因的正確性。 1 2 2s y 2 系列工程茵的制備 $ y 2 感受態(tài)細胞的制備 1 、將冷凍保藏的s y 22 m l 接種于2 m ll b 液體培養(yǎng)基中，3 7 c 搖床培養(yǎng)過 夜； 2 、取5 0 0 d 過夜的培養(yǎng)液轉接于5 0 m ll b 液體培養(yǎng)基中，3 7 c 搖床培養(yǎng) 2 h ： 3 、轉接液置于冰浴中1 0 r a i n ，4 。c4 0 0 0 r p l n 離心沉淀1 2 r a i n ： 4 、將沉淀重懸于1 5 m l 冰冷的t bb u f f e r ，冰浴1 0 r a i n ，4 c4 0 0 0 r p m 離心 沉淀1 2 r a i n ： 5 、將沉淀重懸于4 m l 冰冷的t bb u f f e r ，加入2 8 嘰ld m s o ，冰浴至少1 0 m i n ； 6 、分裝感受態(tài)細胞于0 5 m le p 管中( 每管2 0 ( 0 1 ) ，液氮速凍至少5 m i n ， 后于- - 8 0 。c 冰箱保存。 質粒的提取與電泳 1 、取冷凍保藏的菌液2 嘰l 接種于2 m ll b 液體培養(yǎng)基中( a m p 終濃度 5 陬咖1 ) ，3 7 c 搖床培養(yǎng)過夜； 2 、將1 5 1 1 1 1 培養(yǎng)液倒入e p 管，1 2 0 0 0 r p r a 離心3 0 s ： 3 、取細胞沉淀，加入1 0 0 d 冰預冷的溶液i ，劇烈振蕩； 4 、加2 0 0 9 l 新鮮配制的溶液i i 于細菌懸液中，蓋緊管1 ：2 ，快速顛倒5 次混 合內容物，將e p 管置于冰上； 5 、加入預冷的溶液m1 5 吼l ，蓋緊管1 ：3 ，溫和振蕩1 0 次使溶液在粘 稠的細菌中分散混勻，之后置于冰上3 5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 離心5 m i n ： 6 、取上清，加入等體積的酚，氯仿( 約4 5 嘰i ) ，反復混勻，1 2 0 0 0 r p m 離心 2 r a i n 7 、取上清，加入2 3 倍體積無水乙醇( 約8 0 0 # 1 ) ，混勻后，室溫放置5 1 0 r a i n ，1 2 0 0 0 r p m 離心5 r a i n 收集沉淀的雙鏈d n a ； 四川大學碩士學位論文 8 、吸干上清，加i m l7 0 乙醇洗滌質粒，振蕩混合，1 2 0 0 0 r m p 離心2 m i n ， 棄上清，空氣中干燥沉淀； 9 、加3 0 5 即lt e 緩沖液和m lr n a 酶( 2 嘰g h a ) ，3 7 。c 溫浴3 0 m i n ； l o 、將質粒d n a 樣品卻l 與適量l o a d i n gb u f f e r 混勻，連同d n am a r k e r 斯l ，進行瓊脂糖凝膠( o 7 ) 電泳： 1 1 、電泳后的凝膠在紫外光下照相，得到電泳圖譜。 表達載體的構建 1 、分別以b a m hi ，h i n dh i 為作用位點對鹽藻6 4 光裂合酶基因片段 ( d s 6 4 p h r ) 、ec o l ic p d 光裂合酶基因片段、表達載體p e t 3 2 a 進行雙酶切； 2 、d s 6 4 p h r 和c p d 基因片段分別與p e t 3 2 a 載體片段在t 4 連接酶的作用 下，1 6 0 c 連接過夜； 表達載體的構建過程如圖i i 所示。 酶切反應體系： 質粒d n a 4 3 d 1 0 x k b u f f e r5 “l(fā) b a m h ih l 麴d 班 ! 叢l t o t a l 5 0 u l 充分混合均勻，3 t c 溫浴6 8 h ，電泳回收核酸片段； 連接反應體系： 基因片段缸l 載體片段m i 1 0 x t 4b u f f e r1 l t 4 連接酶批l 瑟丞馳l t o t a l1 0 比i 1 4 四川大擘碩士學位論文 充分混合，1 6 c 反應過夜，連接液直接轉化ec o i ls y 2 。 h i 。缸i r b k 雙酶切 j _ 蠢曩豳瞄曩墨奠圈_ d s 昏i p 腿 h i n d m 也舡艘酶切 小 首 圖1 1 工程菌轉化載體的構建 s y 2 的高效轉化 l 、取出感受態(tài)細胞室溫溶解，在3 個各裝有2 0 嘰l 感受態(tài)細胞的e p 管中 分別加入l 毗lp e t 3 2 a 、p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 和p e t 3 2 a - c p d ，輕輕旋轉以混勻內 容物，冰浴3 0 m i r l ； 2 、將冰浴后的感受態(tài)細胞置于4 2 。c 水浴中，熱激9 0 1 2 0 s ( 秒表計時) ； 3 、快速將e p 管轉移至冰浴，冷卻3 5 m i n ； 4 ，每個e p 管中加入8 0 0 , 1 的s o c 培養(yǎng)基，用循環(huán)水浴將培養(yǎng)基加熱1 5 m i n 至3 7 等溫； 5 、將e p 管轉移至3 7 c 搖床，孵育4 5 r a i n 使細菌復蘇并表達p e t 3 2 a 質粒 編碼的a m p 抗性基因； 6 、溫育后的細胞培養(yǎng)液5 0 0 0 r p m 離心5 r a i n ： 7 、棄上清，留約1 0 0 u 1 重懸沉淀，充分混合均勻后涂平板( 培養(yǎng)基含5 0 t g m l 四川大學碩士學位論文 a m p ) ，3 7 。c 培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，平板待檢。 s y 2 系列工程菌的驗證 1 、對分別轉入了p e t 3 2 a 、p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 和p e t 3 2 a - c p d 的s y 2s e 程 菌挑取單菌落，進行液體培養(yǎng)，提取質粒； 2 、所得質粒連同1 5 ，0 0 0 b p 的d n am a r k e r ，o 7 瓊脂糖凝膠，7 5 v 電泳 4 0 m i l l ； 3 、電泳完畢的凝膠在紫外光下照相，得到電泳圖。 s y 2 系列工程菌l b 固體平板的準備 1 、在3 支裝有2 m ll b 液體培養(yǎng)基( a m p 終濃度為5 毗咖1 ) 的試管中， 分別接種s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 各2 0 “l(fā) ，3 7 0 c 搖床培養(yǎng)過夜； 2 、次日，取出培養(yǎng)菌液，各取l r n l 于1 5 m le p 管內，分別加入衄li p t g ( 終濃度為i m m o l l ) ，2 8 c 搖床誘導培養(yǎng)4 h ： 3 、誘導后的菌液取s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a c p d 各5 嘰i 于1 5 m l e p 管內，分別加入滅菌雙水，稀釋1 0 倍； 4 、稀釋l o 倍的菌液在4 0 倍顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)； 5 、按照各自的計數(shù)結果，計算確定涂布平板時相應的菌液用量( 菌液用量= 1 0 0 0 ( 計數(shù)均值俗) ，也即涂布到平扳上的總菌數(shù)約為2 1 0 8 ； 6 、按照計算結果各取相應的菌液于新的1 5 r n le p 管，1 0 0 0 0 r p m 離心5 r a i n ， 留約5 0 a l 上清重懸菌體，備涂平板； 7 、將準備好的菌液涂布在含a i n p5 0 z e c r n l 的l b 固體培養(yǎng)基上，涂好的平 扳光下靜置2 0 m i n 。 1 2 3d s 6 4 p h r 在s y 2 中的功能鑒定 1 、d s 6 4 p h r 在s y 2 中光修復功能的初步驗證： 涂布s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 的平板各2 個進行實驗，實驗重復5 次。 四川大學碩士學位論文 6 個平板采用0 2 5 j m 2 的紫外線進行開蓋照射； 照射完畢立即蓋上蓋子，每個樣品各取1 個用報紙包嚴( 不透光) ，3 7 。c 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 0 h ，另3 個平板在可見光源下放置3 0 m i n 進行光復活，再用報紙 包嚴( 不透光) ，3 7 。c 培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 0 h ； 統(tǒng)計菌落數(shù)，繪制曲線圖并對數(shù)據加以分析 2 、紫外線強度梯度實驗： 涂布s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 的平板各6 個進行實驗。 平板采