HPV基因分型檢測試劑盒常見問題PPT課件.ppt

HPV基因分型檢測項目臨床試驗實際問題,1,.,目錄,試驗開展實驗室要求HPV臨床樣本的采集方法及注意事項臨床試驗操作注意事項臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,2,HPV基因分型檢測試驗項目試驗開展實驗室要求,3,.,臨床基因擴增實驗室設置的一般原則,各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作,“十六字方針”,4,基因擴增檢驗實驗室工作流程,進入各個工作區(qū)必須遵循嚴格的單一方向順序!,5,最佳的HPV基因分型實驗室布局,出口,入口,工作流向,臨床樣本收集與儲存,PCR前區(qū)域,PCR后區(qū)域,6,最佳的HPV基因分型實驗室布局,每間房間必須有其專用的工作服及一次性手套；每個工作區(qū)都應有獨立的一套儀器設備及耗材；不同區(qū)域的儀器設備及耗材不能混用;,臨床樣本(原始容器中),樣本制備區(qū),試劑準備區(qū),超凈工作臺,DNA提取,PCR擴增區(qū),導流雜交區(qū),結(jié)果通知患者,7,基礎HPV基因分型實驗室布局（1）,臨床樣本(原始容器中),樣本制備區(qū),超凈工作臺,DNA提取,導流雜交區(qū),結(jié)果通知患者,PCR區(qū)域,8,基礎HPV基因分型實驗室布局（2）,每個區(qū)域必須有其專用的工作服及一次性手套；每次操作必須更換；涉及到公用儀器使用，必須注意防止交叉污染，定時使用次氯酸鈉溶液擦洗；,9,實驗室環(huán)境注意事項,工作區(qū)域必須始終保持清潔整齊；所有實驗臺面及地面均應保持清潔；所有實驗廢料及垃圾使用專用垃圾帶裝好后，封口處理；在每次工作前后對工作臺面進行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后開啟紫外燈進行滅菌；,10,實驗室制度及人員配備,有效的臨床結(jié)果,嚴格規(guī)章制度并遵守,操作人員具有專業(yè)技術知識和經(jīng)驗,強烈責任感工作態(tài)度認真細心,嚴格遵守HPV基因分型各項工作的標準操作規(guī)程,11,實驗所需儀器,HybirMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀,PCR擴增儀,超凈工作臺,水浴鍋,離心機,旋渦混合儀,微量移液器,12,HPV基因分型檢測試驗項目HPV臨床樣本的采集方法及注意事項,13,.,HPV臨床樣本的采集方法及注意事項,標本收集標本保存,14,標本收集,檢查前告知病人注意事項：月經(jīng)正常婦女，在月經(jīng)來潮后1018天為最佳檢查時間。檢查前48小時內(nèi)不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物。檢查前48小時最好不要行性生活。檢查前不進行醋酸或碘液涂抹。,15,標本收集,步驟先脫掉褲子，然后按醫(yī)生指示仰臥于一張檢查床上。,步驟二由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸。然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口采集標本。（最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物）,16,標本收集,步驟四慢慢取出宮頸刷，將其放入標有病人編號的取樣管中，取樣管內(nèi)已加有專用細胞保存液，折斷其刷頭入管中，擰緊瓶蓋。,步驟三將專用宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉(zhuǎn)5圈。,17,標本保存,樣本一經(jīng)采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。如若不能馬上送檢樣本，請于4保存，請在2個星期之內(nèi)進行檢測。,18,標本收集,標準收集中注意事項：使用凱普專用取樣器及保存液，可抑制細菌生長，保持DNA完整性。樣本收集中為保留足夠的宮頸細胞標本，注意切勿將宮頸刷頭丟棄。宮頸保存系統(tǒng)包裝打開后，必須立即進行采樣，并連同刷頭置于取樣管中。如果同時進行細胞學檢查，應先采細胞學樣品。宮頸刷頭折斷、試驗取樣時，請小心操作，切忌大力震蕩取樣管，造成試劑及樣本濺出影響檢測結(jié)果或造成污染。取樣管上標示的名稱須與患者一一對應。取樣后，切記擰緊取樣管管蓋。,19,HPV基因分型檢測試驗項目臨床試驗操作注意事項,20,.,因操作欠規(guī)范導致的問題分析,21,移液器：,嚴禁大力來回擰動；嚴禁調(diào)至容量之外使用；第二檔為排空檔，不得作吸取之用；吸頭應浸入液面23mm處吸取；嚴禁將有液體的移液器平放或倒置；混勻沉淀時，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復吸取液體，將沉淀反復混勻，溶解；每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時清洗。,22,（二）實驗室布局不合理引起的污染問題,1、樣品處理不進行隔離，樣品中各種核酸片段均會通過空氣進行傳播。2、PCR結(jié)果檢測實驗室和其它實驗室在一起，會出現(xiàn)嚴重的擴增子污染。3、儀器設備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會造成嚴重污染。4、實驗室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實驗室污染。,23,（三）PCR操作中存在問題分析,1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定,24,1.陽性變陰性,(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標本方法或部位不正確，二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。,25,(2)標本保存不當，可引起PCR失敗。收集的標本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測的核酸降解，失去了PCR檢測的模板或造成標本污染。,26,2.陰性變陽性常見的原因有以下5點：,27,加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應，所有并非即用管都應蓋嚴）。,28,打開標本管蓋引起樣品飛濺（打開前須瞬間離心）操作時手套引起的交叉污染（拿過模板DNA管后應更換手套）,29,不明原因引起公用試劑污染（必須設置一個不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應。這一對照管須在準備好所有其他PCR以后才進行吸加）。實驗室污染,30,臨床試驗操作注意事項,實驗室建設方面HPV分型檢測試驗操作方面DNA提取PCR擴增導流雜交(詳見各項操作的SOP）,31,臨床試驗操作注意事項實驗室建設方面,一、實驗室分獨立房間操作:樣本儲存區(qū)（與試劑儲存分開）PCR前區(qū)域(試劑貯存及準備區(qū),樣本處理區(qū))PCR后區(qū)域(PCR擴增產(chǎn)物分析區(qū))儀器及耗材獨立使用，切忌前后區(qū)域交叉！試驗工作服及手套獨立二、單一工作流程:PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域三、實驗室環(huán)境（防止污染、保持清潔整齊、嚴格制定及執(zhí)行各項規(guī)章）四、試劑管理及標本管理試劑按要求溫度貯存、注意有效期，使用過的試劑擰緊歸類放好；樣本清楚標記好樣本號、與試劑分開貯存，使用過的樣本歸類放好五、以謹慎的態(tài)度對待，并清楚記錄實驗結(jié)果及一些突發(fā)性問題；,32,臨床試驗操作注意事項DNA提取,使用移液器吸取臨床樣本時，避免移液槍頭碰到樣本管壁。所用移液槍頭均為一次性用品，切忌重復使用；,防止造成樣本交叉污染,防止造成試劑被污染,正確使用移液器,33,臨床試驗操作注意事項DNA提取,盡可能使用帶有濾心的移液器槍頭,防止形成氣溶膠污染實驗室環(huán)境,防止樣本DNA污染移液器槍管,34,臨床試驗操作注意事項DNA提取,DNA提取操作步驟注意事項：加入溶液之前,應確保溶液中沒有沉淀出現(xiàn)!以免影響提取效率.加入臨床樣本時,最好在超凈工作臺前操作,且將用過的槍頭打入到盛有10次氯酸鈉的廢液瓶中,以免樣品交叉污染,影響以后的PCR檢測.在煮沸樣品時,切記不要讓沸水濺入到樣品管中!建議水沸騰后調(diào)低火力.每次去上清時,盡量去干凈,特別是第3步驟,以免影響提取效果.在做PCR之前,最好將提取的樣品離心5分鐘,取樣時盡量不要將槍尖碰到管底的沉淀。,35,臨床試驗操作注意事項PCR擴增,正確使用移液槍,防止造成樣本交叉污染,防止造成試劑被污染,36,臨床試驗操作注意事項PCR擴增,盡可能使用帶有濾心的長頭移液器槍頭,防止形成氣溶膠,防止樣本DNA交叉污染,防止樣本污染試劑,37,臨床試驗操作注意事項PCR擴增,防止造成試劑被污染移液槍頭均為一次性用品,切忌重復使用移液槍頭盡可能為帶有濾芯每個區(qū)域必須用專用儀器、耗材。進入不同房間必須穿專用工作服及帶手套，離開時必須先脫去工作服及手套。PCR后操作區(qū)域房間內(nèi)的所有耗材及儀器均不能與PCR前區(qū)域混合使用。使用前后均以次氯酸消毒液清理。,38,臨床試驗操作注意事項PCR擴增,HPV58,HPV18,HPV16,PCR操作不當造成污染：,39,臨床試驗操作注意事項導流雜交,雜交及雜交后清洗溫度（45C）。每次清洗膜后，抽液干凈。確保PCR產(chǎn)物變性成功。遵守封阻反應溫度及時間、酶標反應時間及顯色反應時間，確保雜交結(jié)果背景正常。正確使用移液器，移液槍及槍頭專用。,40,HPV基因分型檢測試驗項目臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,41,.,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,HPV陽性正常結(jié)果,HPV陰性正常結(jié)果,42,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,一、雜交結(jié)果中IC點不清楚，同時陽性點也不清楚或比較淡；可能原因：雜交溫度控制不當，出現(xiàn)非特異性雜交點；DNA樣本中有對PCR反應的抑制物質(zhì)，影響了PCR擴增的效率；確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。病人樣本是否取樣前是否違反了取樣要求？將DNA樣本稀釋10倍后，重新PCR擴增及雜交反應可解決。,43,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,二、雜交結(jié)果中，在雜交膜上既無IC點，也沒有HPV分型陽性點顯色；可能原因：可能是因為DNA模板中存在抑制PCR反應的抑制物質(zhì)，首先,通過抽提得到的DNA的純度對PCR反應會有很大影響,所以必須在做PCR模板的時候?qū)⑵湎♂審亩档虳NA溶液中抑制劑的濃度,使得PCR反應能正常進行，在一家新的醫(yī)院開始試驗的時候均需要摸索本院樣本自身的特點?；蛘咚颖?，不符合凱普HPV分型檢測說明書中對樣本的要求，樣本之前經(jīng)過碘染色或者病人使用了陰道沖洗藥物，均會對PCR反應產(chǎn)生抑制。確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。如果這些情況的時候，建議對樣本稀釋10倍重新PCR，然后雜交，結(jié)果仍然不成功的情況下，建議按照凱普說明書要求重新取樣檢測。,44,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,402721,403022,403040,403078,稀釋1:10DNA模板重復PCR,45,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,三、雜交結(jié)果中IC點沒有，同時陽性點淡或不清楚；可能原因：樣本中含有抑制PCR反應的物質(zhì)；樣本中HPVDNA濃度較低，同樣本中含有抑制PCR反應的物質(zhì)；病人樣本不符合凱普分型試驗要求，樣本本身為陰性結(jié)果，但因為樣本中有抑制PCR反應的物質(zhì)，同時操作人員對雜交溫度又控制不當，出現(xiàn)非特異性雜交點；建議增加用于擴增DNA濃度，重新PCR擴增及雜交反應。,46,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,四、IC點弱或者沒有，但HPV分型陽性點顯色正?？赡茉颍河捎贗C和HPVDNA之間存在競爭，高濃度的HPVDNA可能會對IC點的擴增反應產(chǎn)生競爭性抑制，此現(xiàn)象出現(xiàn)時如HPV分型點顯色正常，則認為分型結(jié)果正確。,47,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,六、Biotin（生物素）點不顯色可能原因：請確認所使用試劑是否仍在有效期內(nèi)。尤其是酶標液及顯色液是否按要求使用及儲存。確定實驗操作是否嚴格按照說明書進行、且試劑是否按要求保存使用。,48,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,七、陰性對照顯現(xiàn)HPV分型陽性點可能原因：PCR試劑可能被污染，取5lPCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。重復進行PCR及雜交試驗,。,49,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,八、雜交膜有很高的背景可能原因：可能由于封閉不足，使未結(jié)合的酶標殘留在膜上。確保封閉液完全覆蓋整個雜交膜。也可能因為沒有完全將未結(jié)合的試劑清洗干凈，請確保在顯色過程中雜交膜充分清洗，無剩余殘留液體。,50,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,九、封阻液抽不動可能原因：仔細觀察封阻液是否有絮狀微生物或澄淀，如果有則證明封阻液有發(fā)霉跡象，是由于操作中沒有使用滅菌槍頭而造成的。重新購買封阻液，同時確保試驗中使用已滅菌的移液槍頭,51,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,十、什么時候需要做陽性及陰性對照當一個新的醫(yī)院，一個新的地方開展試驗的時候，或更換試驗地點的時候，需要進行陰陽性對照試驗；當使用的檢測試劑批次改變的時候需要做1次陰陽性對照；當雜交結(jié)果出現(xiàn)令人疑惑，比如多個樣本的雜交結(jié)果一樣，或者雜交結(jié)果出現(xiàn)過多的多重感染，以及雜交試驗后出現(xiàn)許多無IC點及陽性雜交點的結(jié)果等情況下，需要使用同批試劑進行陰陽性對照試驗以驗證問題所在；,52,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,十一、導流雜交試驗中的污染主要會出現(xiàn)在那一步中，應該怎樣防范？首先，污染情況主要由PCR操作中樣本DNA的交叉而產(chǎn)生；對于此種情況，應嚴格按照SOP操作，確保PCR加樣的試驗器材均為專用，特別是移液槍和槍頭。其次，雜交結(jié)果中出現(xiàn)的比較弱的雜交點不是污染造成，而是雜交溫度不符合要求而造成的非特異性點。對于此種情況，應在雜交操作的時候，確保雜交液的45條件，以及雜交儀的溫度是否符合說明要求的誤差范圍顯示。最終結(jié)果如果出現(xiàn)雜交點較弱的情況(肉眼很難看出)，此點可以不用判讀。,53,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,HPV58,HPV18,HPV16,PCR操作不當造成污染：,54,HPV34,弱IC,HPV(-),電泳陽性,其他HPV亞型,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,十二、HPV雜交結(jié)果為陰性，但電泳結(jié)果為陽性可能原因：PCR產(chǎn)物變性操作失敗。導流雜交操作失敗。電泳所檢測到的HPVDNA不包含在凱普試劑盒所能檢測到的21種亞型內(nèi)，此種情況較少。,55,臨床試驗結(jié)果分析及常見問題,十三、雜交后的雜交膜沒有形成均一的雜交邊緣，而且出現(xiàn)同一次雜交結(jié)果互相污染的現(xiàn)象?？赡茉颍涸诜欧指裟さ臅r候沒有放好，沒有形成每