青蒿素的提取與檢測工藝畢業(yè)論文

I 青蒿素的提取與檢測工藝 摘 要 青蒿是常用的功能性植物，青蒿素是從青蒿中提取的一種抗瘧有效成分，為無色針狀結晶，易溶于有機溶劑 ；具有抗白血病和免疫調節(jié)功能它具有低毒、高效、速效的特點 ,在國際市場上供不應求 , 應用及經濟前景十分看好。本論文結合超臨界 CO2提取技術和常規(guī)結晶法研究了從青篙中提取、分離純化青篙素的工藝。通過比較的方法，對青蒿中青蒿素的提取工藝進行了綜述，討論了青蒿素提取工藝的研究方向。青蒿素提取方法主要有傳統(tǒng)有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波萃取法和超臨界流體萃取法 ； 青蒿素檢測技術主 要有紫外分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜 蒸發(fā)光檢測法等。 關鍵詞：黃花蒿 ； 青蒿素 ； 提取 ； 含量檢測 ；微波預處理 ； II Research Progresses on Extraction and Detection Techniques of Artemisinin Abstract Objective The aim was to make a summary on research progresses on extraction and detection techniques of artemisinin Meth- od In the research ， the concerning progress was made based on physicochemical property ， source ， extraction methods and detection technolo- gy of artemisinin Result Artemisinin is colorless acicular crystal and easier to be dissolved in organic solvent The extraction methods of ar- temisinin include organic solvent extraction， ultrasonic extraction， microwave extraction and supercritical fluid extraction； the detection tech- nologies include ultraviolet spectrophotometry， high performance liquid chromatography and HPLC-evaporative light-scattering KEY WORDS: Artemisinin； Extraction； Content detection； Microwave assisted Extraction； High performance liquid chromatog- raphy。 III 目 錄 前 言 . 1 第 1 章 青蒿素的提取方法 . 2 1.1 傳統(tǒng)有機溶劑提取 . 2 1.1.1 冷浸提取 . 2 1.1.2 回流提取 . 2 1.2 超臨界 CO2 萃取 . 4 1.3 微波萃取技術 . 1.4 超聲波強化石油醚提取 . 第 2 章 青蒿素的檢測 . 6 2.1 紫外分光光度法 . 6 2.2 高效液相色譜法 . 2.3 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測法 . 結 論 . 9 參考文獻 . 11 1 前 言 青蒿是菊科植物黃花蒿干燥的地上部分，為我國傳統(tǒng)中藥。藥理研究表明，黃花蒿具有抗瘧、抑制光敏反應、抗腫瘤、抗菌殺蟲、抑制免疫功能亢進、抗心律失常、抗孕、抑制疤痕成纖維細胞、抗單純皰疹病毒等作用，在現代臨床上用于對惡性瘧疾、發(fā)熱、血吸蟲病、口腔黏膜扁平苔蘚、紅斑狼瘡、心律失常的治療 1 ，并且對類風濕性關節(jié)炎的免疫有顯著療效 2 。黃花蒿的有效成分 青蒿素在抗瘧方面與傳統(tǒng)的奎寧類抗瘧藥物具有不同的作用機理。青蒿素是一種倍半萜內脂類化合物 3 ，分子式為 C15H22O5。在青蒿素的基礎上開發(fā)出了多種衍生物，如雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚等，均有抗瘧、抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲、抗弓形蟲、抗心律失常和抑制腫瘤細胞毒性等作用 4 5 。目前，青蒿素用于瘧疾防治的價值已被人類認識和接受，世界衛(wèi)生組織已把青蒿素的復方制劑列為國際上防治瘧疾的首選藥物。青蒿素因其在丙酮、醋酸乙酯、氯仿 、苯及冰醋酸中易溶，在乙醇和甲醇、乙醚及石油醚中可溶解，傳統(tǒng)提取方法一般采用有機溶劑法，后來又出現了超臨界 CO2 萃取技術、超聲波強化石油醉提取、微波輔助萃取技術。本文對青蒿素的提取方法進行綜述，討論了青蒿素提取工藝的研究方向及其檢測方法。 2 第 1 章 青蒿素的提取方法 1.1 傳統(tǒng)有機溶劑提取 1.1.1 冷浸提取 李自勇等 6 采用工業(yè)酒精冷浸法提取青蒿中的青蒿素，以浸漬時固液比、萃取時母液與萃取劑體積比、萃取次數為考察對象，最終確定酒精體積 ( mL) 與青蒿質量 ( g) 比為 10 1，分 3 次提取，母液體積 ( mL) 為青蒿質量 ( g) 的 2 5 倍，萃取劑乙酸乙酯與母液體積比為 1 1，分 4 次萃取，后用活性炭脫色、結晶及重結晶，干燥得到的青蒿素產品產率可達 2 73，純度可達 99%。黃榮崗 7 建立了低溫提取青蒿素的基本流程 : 青蒿葉 加甲醇攪拌提取 提取液低溫冷凍 離心 萃取 精制 青蒿素結晶 檢測。通過單因素考察冷凍液體積、冷凍液甲醇濃度、冷凍時間、溫度 4 個關鍵因素。結果表明 : 隨著冷凍液體積與甲醇比例的增 大，青蒿素的轉移率逐步提升。之后又采用正交實驗，進行上述 4 因素考察。結果表明 : 當甲醇濃度為 70%、濃縮倍數為 1 倍、冷凍溫度為 5、冷凍時間為 3 h 時，所得青蒿素提取率最高，為 82. 5%，含量為 99 3%。后又與柱層析工藝進行比較，表明低溫工藝優(yōu)勢明顯 。 1.1.2 回流提取 韋國峰等 8 探討了青蒿最佳提取工藝，分別比較了冷浸法、回流法、索氏法、超聲法這 4 種方法。以青蒿素標準品為對照，用紫外分光光度法 測定青蒿中青蒿素含量。結果表明 : 回流提取法的提取率和青蒿素含量較高。杜曉英等 9 對用不同提取溶劑 ( 70%乙醇、石油醚、 120#汽油 ) 以及不同提取 工藝 ( 回流提取法、滲漏提取法和冷循環(huán)提取法 ) 所得到的青蒿素用紫外分光光度法進行檢測。結果表明 :以 120# 汽油回流提取法所得的收率和含量最高，并指出以 120# 汽油作提取溶劑的冷循環(huán)提取法適合現代化大規(guī)模生產。鄧素蘭等 10 研究了不同溶劑分離提取青蒿中青蒿素的實驗。結果表明 : 在 50恒溫回流提取 2 次、固液比為 1 10/1 8、時間為 3 2h/1h 的條件下，石油醚 ( 30 60 ) 為最佳溶媒介質， 1%活性炭脫色的效果最佳， 80% 甲醇洗提取液的濃縮浸膏得到進一 步分離純化。此工藝提取分離所 得的青蒿素的結晶經 HPLC 法測定其含量最高 70 761%。 1.2 超臨界 CO2 萃取技術 超臨界 CO2 萃取是基于 CO2 流體在超臨界狀態(tài)下對某些物質具有特殊的增強其溶解度的效應而建立起來的一種新型分離技術。用超臨界 CO2可以代替某些常規(guī)提取溶劑進行有效成分的提取 ,采用最佳工藝條件實現從植物中提取分離得到高純度的化合物的目標。超臨界 CO2 萃取具有反應時間短、選擇性高和無溶劑殘留等優(yōu)點 ,而且其操作溫度較低 ,可似避免低熔點物質分解特別適合于熱敏性天然物質的分離 , 廣泛應用于醫(yī)藥、食品、日用香料等工業(yè)領 域 11 。最近 ,超臨界 CO2 萃取設備中對壓力系統(tǒng)和溫度系統(tǒng)的控制方法也有一定的研究開發(fā) 12 。錢國平 13 等研究了用超臨界 CO2 從黃花篙中萃取青篙素的影響因素。在 15 . 2 2 9 . 7 M Pa 和 40 60 范圍內 ,隨著壓力和溫度升高 ,萃取率增大 , 萃取選擇性下降。以萃取率和萃取選擇性為目標 ,優(yōu)化了超臨界萃取工藝條件 , 得到較佳的操作條件。實驗數據表明 ,用超臨界 CO2 從黃花離中萃取青篙素 , 得到純度 10 % 以上的萃取物 ,其質量傳遞受植物細胞內部擴散控制 , 因此對黃花篙植株 必須進行粉碎 ,粒徑以 60 80 目為宜。操作條件對萃取率和萃取選擇性有很大影響。在一定溫度下 , 壓力升高 , 萃取率增大 , 萃取選擇性下降 ； 在一定壓力下 ,溫度升高 ,萃取率增大 ,萃取選擇性下降 CO2流速太大 ,萃取流體中青篙素濃度遠達不到飽和溶解度 ,浪費 CO2 和壓縮功 ,而 CO2流速太小 ,需延長萃取時間。實驗優(yōu)化得到較佳工藝條件為萃取壓力 20 M Pa , 萃取溫度50 ,每 kg 原料每小時通 CO2 (液態(tài) ) 1 kg , 萃取時間 4 h ； 原料中存在一定比例的水起到夾帶劑的作用 ,對萃取有利 ,用熱球模型 擬合了萃取動力學數據 ,表明擴散系數隨壓力和溫度升高而增大。用超臨界 CO2從黃花篙中萃取青篙素 ,可以得到純度 15% 以上的萃取物 ,萃取率達到 95 % 以上 14 。從中藥現代化的角度來講 ,今后用超臨界流體萃取技術萃取中藥有效成分的工藝研究還會不斷發(fā)展 ,可以預見 ,隨著研究的不斷深人 , 超臨界CO2流體萃取技術在中藥有效成分提取方面將發(fā)揮出更大的作用 15。 4 1.3 微波萃取技術 微波萃取又稱為微波輔助萃取 ( Microwave assisted Extraction， MAE)，是指用合適的溶劑在微波反 應器中從天然藥用植物、礦物、動物組織中提取各種化學成分的技術和方法。微波指頻率在 300M 和 300 kM Hz 之間的電磁波 16 17 。經研究表明 :微波萃取法具有萃取時間短、溶劑用量少、提取率高、溶劑回收率高、所得產品品質好、成本低、投資少等優(yōu)點。韓偉等 18 采用微波輔助提取法提取青蒿中的青蒿素，發(fā)現青蒿素提取率隨物料粉碎度的增加而提高，其中以 120 目青蒿粉末為原料時，青蒿素的提取率最高 ； 隨著微波輻射時間的增加，青蒿素的提取率也隨之增大，但最終趨向于恒定，在前 10 min 內增加趨勢明顯， 10 min 后增大趨勢緩慢， 并在 12 min 后有微弱的下降，因此微波輻射時間以 12 min 為 宜 ； 隨著溶劑比的增大，青蒿素的提取率有明顯的提高。郝金玉等采用微波輔助提取法提取青蒿中的青蒿素，并對提取溶劑乙醇、三氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷、石油醚 ( 30 60 和 60 90 2 種 ) 、 120 號溶劑油和 6 號抽提溶劑油進行了比較，考察了溶劑的介電常數對青蒿素得率的影響，同時將微波輔助提取法同索氏提取、超臨界 CO2 提取以及加熱攪拌提取法進行了比較，結果顯示，要達到微波輔助提取 4 6 min 的提取效果， 用傳統(tǒng)的熱提取、索氏提取法需要幾個小時甚至十幾個小時以上的時間，因此微波輔助提取能大幅提高提取速率。梁忠生 19 用微波預處理的方法對青蒿素提取產率進行研究，發(fā)現與無微波預處理相比，微波預處理可提高青蒿素產率 15 個百分點，當 20 號溶劑汽油為溶劑，微波預處理功率 450 W，預處理時間 240 s，索式提取時間 6 h 時，提取率和產率分別達 0 49% 和88%以上。由此可見，用微波預處理青蒿干粉，亦可顯著地提高青蒿素的提取率。 1.4 超聲波強化石油醚提取 超聲波應用于生物技術是一個較新的研究領域。近年來超聲波 在高分 子化合物降解、有機合成、提取分離等方面得到了廣泛的研究及應用 ,如多糖的降解及提取 20。中草藥原料所含成份相當復雜 ,不僅含有效成份 , 還 5 含有許多無效成份及雜質 ,有效成份的提取率將直接關系到成品藥的治療 效果。應用超聲波提取法具有操作方便、提取時間短、提取率高等優(yōu)點 21。目前對超聲波用于從植物中提取藥用有效成份進行了較多研究 22-25 , 都取得了較滿意的效果 ,回收率大大提高。我國工業(yè)化超聲波提取設備的研究也已經有了一定的發(fā)展。第一套生產型連續(xù)化管道式多功能超聲波提取機組于 2002 年底在成 都得到實際生產應用 , 每小時可提取 150 kg 的植物藥材 , 提取時間縮短至 50 min 以內 ,得率提高 20% 左右 ； 第一套生產型連續(xù)化釜雛式多功能超聲波提取機組 2003 年在哈爾濱得到實際生產應用 26。趙兵 27等人采用超聲波強化石油醚提取青篙素 ,為改進現有青篙素提取工藝、縮短提取時間、降低提取成本、提高產品質量提供了一些依據。他們將超聲波強化石油醚提取青篙素的工藝過程與常規(guī)石油醚提取比較 ,發(fā)現用超聲波不僅可以大大縮短提取時間 ,減少提取產物中雜質的含量 ,而且還可以降低溶劑的消耗。此實驗還對超聲波強度 、超聲波處理時間、攪拌時間、超聲波處理間歇次數等實驗數據進行分析 ,得出結論 : 超聲波用于強化石油醚提取青篙素時 ,采用 20 kHz、 90 W 超聲波 , 在 50 下 , 單次作用20 min 后繼續(xù)攪拌至 30 min 時 , 提取率可達 83% ； 而用超聲波處理 6次 ,每次處理 2min , 共計 12 min , 提取相同時間 ,提取率可達 81 % , 與1 000 r/ m in 攪拌提取 2 h 的提取率相同。 6 第 2 章 青蒿素的檢測 2.1 紫外分光光度法 青蒿素最大吸收峰波長為 205 nm，吸收系數小，干擾嚴重 ，不能直接用此峰進行定量分析。青蒿素遇稀堿后結構發(fā)生定量轉化，其產物 292 nm 處有一強吸收峰，故可用紫外分光光度法進行檢測。周濃等 28 采用紫外分光光度法研究了云陽縣不同產地青蒿所含青蒿素的差異。其檢測波長為292 nm，結果顯示對照品在 0 02 0 14 mg/L 范圍內具良好的線性關系， r = 0 999 8 平均回收率為 98 81% ( n = 7) ，方法精密度試驗 RSD =0 38%。李春莉等 29 用紫外分光光度計對青蒿素標準溶液進行波長掃描，確定最適吸收波長，并在最適吸收波長下建立青蒿素 標準品的吸光度濃度曲線，根據標準曲線測定青蒿樣品中青蒿素的含量，結果顯示，青蒿素的最適吸收波長為 290 5 nm，吸光度濃度回歸方程為 : Y =0 043X + 0 006，不同青蒿樣品中青蒿素含量有差異。陳迪釗等 30 采用紫外分光光度法對提取溶劑的選擇、青蒿提取物與 NaOH 反應情況及最佳青蒿素堿轉化條件進行了研究，發(fā)現以正己烷或石油醚等非極性類溶劑作提取劑，對青蒿素的提取率較高，提取物中雜質含量較低 ； 提取物中非青蒿素成分與 NaOH 反應能快速完成，且一般不引起 292 nm 附近吸收值的變化， 因此不干擾青蒿素含量的測定 ； 青蒿素堿轉化反應可選擇在 25下與 0 3%的 NaOH 作用 30 min， 或 50下與 0 2%的 NaOH 作用 20 min； 該方法的相對標準偏差 RSD =1 84，相關系數 r =0 999 5，回收率為 98 102%。 2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法是 20 世紀 70 年代迅速發(fā)展起來的一種高效、快速、高選擇性、高靈敏度的新型分離分析技術。高效液相色譜法在藥物分析中的應用主要是鑒別相關物質、檢查藥物中有關物質的含量限度及測定有效成分或主要成分含量。高效液相色譜法具分析 速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、檢測自動化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡單等優(yōu) 7 點，還可在檢查雜質的同時進行含量測定，為分析工作節(jié)約了很多時間，同時也降低了分析成本，因此在各類藥物的鑒別、檢查和含量測定中能充分發(fā)揮其他分析方法無法比擬的優(yōu)勢。黃玉蘭等 31 采用高效液相色譜法，以甲醇磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液 (分別取 0 1 mol/L 磷酸氫二鈉和 0 1 mol/L 磷酸二氫鈉溶液各 100 ml 置 1 000 ml 量瓶中，加水定 容至 1 000 ml) ( 55 45) 為流動相，流速 1ml/min，柱溫 35 ，檢測波長 260 nm 為條件，測定青蒿素的含量，研究表明該方法對青蒿藥材中青蘺素檢測重現性較好，青蒿素在 5 163 82 608 g/ml 之間有良好的線性關系，加樣回收率為 97 5%，相對標準偏差 RSD =1 2%( n =5) 。陳益元等 32 用無水乙醇提取青蒿草中的青蒿素，并用高效液相色譜法對其 進行測定，流動相為甲醇 ( 10 mmol/L) 磷酸鹽緩沖液 ( 60 40) ，流速為 1 0 ml/min，檢測波長為 260 nm，結果顯示該方法在青蒿素濃度為5 0 25 0 mg/L 范圍時線性相關系數 r =0 9998，加標回收率在 90 5% 98 5%之間， RSD 在 0 93% 1 51% 之間 ； 青蒿草中青蒿素的含量在 0 554% 1 020%之間。熊春媚等 33 用高效液相色譜法測定青蒿中青蒿素含量，采用安捷侖 ZORBAX Stable Bound ( 4 6 mm 150 mm，0 5 mm) 色譜柱，外標法定量，流動相為乙腈水 ( 體積比為 44 56) ，流速 1 0 ml/min，檢測波長為 210 nm，在該色譜條件下青蒿素在 20 min 內 可達到基線分離，該方法加標回收率為 99 5%， RSD =4 32%， 在 130 g 范圍內呈現良好的線性關系， r =0 99999，表明該方法簡便、快速，結果準確可靠。朱華李等 34 采用 HPLC 法測定青蒿素含量，色譜柱為Agilent C18柱，流動相為乙腈水 ( 65 35) ，流速 1 ml/min，檢測波長205 nm，結果顯示青蒿素進樣量為 6 0 50 0 g 時與峰面積的線性關系良好， r =0 9999( n =6) ，平均回收率為 100 1%， RSD =1 3%。 2.3 高 效液相色譜蒸發(fā)光檢測法 惠玉虎等 35 采用 HPLC ELSD 法測定青蒿提取物中青蒿素的含量，所用色譜柱 InertsilODS23 ( 150 mm 416 mm， 5 m) ，流動相為乙腈水 ( 69 31，用三氟醋酸調 pH 至 3) ，檢測器漂移管溫度 45 ，柱溫25 ，結果發(fā)現青蒿素峰面積的常用對數值與其質量濃度的常用對數值線 8 性關系良好 ( r =0198 9) ； 樣品平均回收率 98 171%( RSD 為 0 142%， n =6) ，說明該方法靈敏、準確可靠，可作為青蒿提取物中青蒿 素的定量方法。 周翱翱等 36 首次建立高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿素含量的方法，并對大量的青蒿樣品進行含量測定，所用色譜柱迪馬公司 Diamon2sil C18( 250 mm 416 mm， 5 m) ，流動相甲醇水 ( 75 25) ，流速 1 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度 40 ，載氣壓力 315 bar，放大系數 ( gain) 為 9，進樣體積 20 L，結果發(fā)現青蒿素在 1 5 g 范圍內線性關系良好，回收率為 99 133%，說明該方法具有良好的精密度和重現性，結果準確可靠，可作 為青蒿藥材及青蒿素類產品的質量控制方法，為青蒿藥材的收購及栽培等提供依據。張東等 37 建立了 HPLC ELSD 測定青蒿素片中青蒿素含量的方法，并用于青蒿素片中青蒿素含量的測定。他們所用色譜柱 Thermo C18( 416 mm 250 mm， 5 m) ，以甲醇水 ( 8020) 為流動相，流速為 110 ml/min，柱溫為 25 ，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度 60 ，載氣 ( N2) 壓力 518 10 3 Pa，增益值為 50，結果發(fā)現青蒿素在 11 002 41 008 g 內呈良好的線 性關 系 ( r =99 96%) 平均加樣回收率為 99 145%，說明該方法簡單、準確、重復性好，可用于測定青蒿素片中青蒿素的含量。陳靖等 38 等采用 HPLC UV ELSD 聯用，建立青蒿葉片中青蒿素及其相關倍半萜的含量測定方法，他們采用 Venusil XBP C18 色譜柱 ( 200 mm 4 6 mm， 5 m) ，流動相 : 乙腈水梯度洗脫，檢測波長 203 nm，流速 1 0 ml/min， ELSD 載氣壓力0 35 MPa，噴嘴溫度 35 ，漂移管溫度 60 ，檢測器 UV ELSD 聯用，測定了青蒿葉片中青蒿素、青蒿素 B、去氧青蒿素含量，并在同一色譜柱條件下將流動相改為乙腈水甲酸 ( 體積比為 60 00 40 000 08) ，檢測波長改為 215 nm，檢測器改為 UV 檢測器，測定青蒿葉片中青蒿酸含量，結果發(fā)現 4 種倍半萜在各自的線性范圍內線性關系良好 ( r 0 999 0) ， RSD 3 %，平均加樣回收率分別為 98 5%( RSD = 2 3%) 、96 5% ( RSD = 1 8%) 、 97 5% ( RSD = 3 6% ) 、 95 4%( RSD =2 5%) ，說明該方法可作為青蒿中青蒿素及其相關倍半萜含量的測定方法。 對青蒿素定量檢測的方法有很多種，有重量法、雙波長薄層掃描法 39 、紫外分光光度法、高效液相色譜法 ( HPLC) 、反相高效液相色譜法 40 、紅外光譜 9 法 41 、毛細管電泳法 42 、高效液相色譜蒸發(fā)光檢測法 43 、 RP高效液相色譜法 44 。目前主要采用的是高效液相色譜法 ( HPLC) 和紫外分光光度法。紫外分光光度法操作簡單，投資不大，而高效液相色譜儀器投資大，運行成本較高，采用何種檢測方法，一般是由 不同的研究者根據自己的研究條件而定。 洛陽理工學院畢業(yè)設計論文 10 結 論 青蒿素在青蒿中含量很低，不同品種的青蒿青蒿素含量差異較大，提取率低，無法滿足市場上的需求，因此一方面應加強青蒿的遺傳育種工作，探索影響青蒿素含量的因素，提 高青蒿中青蒿素含量，培育青蒿良種用于栽培 ；另一方面應加強青蒿素提取方法及檢測技術的改進，采用先進的提取方 法提取青蒿素。傳統(tǒng)有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波 萃取法、超臨界 CO2 萃取技術等幾種方法在提取青蒿素方面都有利有弊。工業(yè)上大規(guī)模提取青蒿素目前仍采用有機溶 劑法，檢測技術主要是用紫外分光光度法或高效液相色譜法。隨著各項提取新技術的發(fā)展和應用，會逐漸取代傳統(tǒng)的有機溶劑提取，從實驗室走向工業(yè)化，不斷提高青蒿素的得率，進而提高經濟效益。 洛陽理工學院畢業(yè)設計論文 11 參考文獻 1 金美花青蒿的藥理作用與臨床新用 J 現代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2009， 25( 15) :2352 2 丁小芬， 胡紅青蒿治療類風濕性關節(jié)炎的免疫藥理作用 J 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志， 2006， 12( 1) : 75 76 3 Hsu E The history of qing hao in the Chinese materiamedica J Trans R Soc Trop Med Hyg， 2006， 100:505 508 4 楊耀芳青蒿素及其衍生物的藥理作用和臨床應用 J 中國臨床藥學雜志， 2003， 12( 4) :253 257 5 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