Taq酶提取protocal.doc

Rapid Purification of High-activity Taq DNA Polymerase本次試驗(yàn)歷時(shí)六天，分為準(zhǔn)備工作（兩天），酶的誘導(dǎo)表達(dá)（一天），酶的提?。ㄒ惶欤?，酶的透析以及酶的保存（兩天）。下面按時(shí)間順序敘述。第一天 準(zhǔn)備工作（1）清洗器皿。100ml量筒：34個(gè)1000ml量筒：12個(gè)500ml量筒：23個(gè)250ml量筒：1個(gè)（沒有亦可）1000ml燒杯：2個(gè)小燒杯：2個(gè)500ml三角瓶：1個(gè)150ml三角瓶：23個(gè)500ml離心管：4個(gè)250ml離心管：2or4個(gè)50ml離心管：12or6個(gè)10ml移液管：56個(gè)藥勺：34個(gè)透析袋+超純水（滅菌）透析夾+超純水（滅菌）細(xì)菌濾+濾膜（滅菌，切勿烤干?。岊^（1ml12盒，0.2ml2盒） 小管（1.5ml1瓶，滅菌）定性濾紙：兩包新的10ml離心管：滅菌，保存酶用。磁轉(zhuǎn)子：蒸餾水洗，不必滅菌。同時(shí)準(zhǔn)備一大瓶超純水備用。Note：（一）整個(gè)清洗過程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。（二）器皿最后都要用超純水潤(rùn)洗，倒放在濾紙上干燥。包上牛皮紙滅菌。（三）離心管干燥后封口滅菌。（四）藥勺用鹽酸處理除去污漬銹斑，滅菌。（2）配LB培養(yǎng)基。（按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配方）2L滅菌。預(yù)備明晚?yè)u菌。（3）菌種活化，劃單斑。取98.11的DJP菌種劃單斑，37培養(yǎng)，預(yù)備明晚?yè)u菌。Note： 提取Taq酶每次只用上次保存的菌種，每次搖菌后都要保存菌種！PROCEDURAL EXPLANATION：作蛋白表達(dá)的細(xì)菌和感受態(tài)細(xì)菌都要經(jīng)過轉(zhuǎn)瓶活化過程。第二天 準(zhǔn)備工作（1）將昨晚劃的平板放在4預(yù)備晚上搖菌。（2）配溶液Buffer A，Lysis Buffer，Storage Buffer并滅菌。Buffer A：50mM TrisHCl pH7.950mM Dextrose1mM EDTAK+配法：（FOR 400ml induce PreLysis Buffer）1M TrisHCl（pH7.9） 20ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.8ml Dextrose 3.6g加超純水至390ml，pH計(jì)調(diào)至7.9，定容至400ml。Note：（一）pH值要在7.9以上，7.910以下。（用KOH和HCl調(diào)）（二）最后酶要懸浮在Buffer A中，因此要用超純水。其他緩沖液用蒸餾水即可，也可用超純水。Lysis Buffer：10mM TrisHCl （pH7.9）50mM KCl1mM EDTAK+（pH7.9）0.5%（v/v）Tween-200.5%（v/v）NP401mM PMSF（用前再加）配法：（FOR 200ml）1M TrisHCl（pH7.9） 2ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.4ml1M KCl 10ml10% Tween20 10ml10%NP40 10ml滅菌后加入PMSF 0.03484g。（以約300500l異丙醇溶解，緩慢加入）Note：PMSF可用異丙醇溶解后緩慢加入，也可直接將粉末倒進(jìn)去劇烈振蕩。（PMSF劇毒，注意防護(hù)）PreLysis Buffer：即Buffer A中加Lysozyme至4mg/ml。（現(xiàn)配現(xiàn)用）1Storage Buffer：（200ml，溶解酶用，-20保存）50mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK+50mM KCl0.5mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 10ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.04ml1M KCl 10mlPMSF 0.01743g定容至100ml，再加甘油100ml。滅菌后加入過濾除菌的DTT。1M DTT過濾除菌后加入0.2ml，即終濃度為1mM（配法：1.543g10ml超純水或0.7715g5ml超純水，過濾除菌后小管分裝。-20保存）Note：（一）PMSF可用異丙醇溶解后緩慢加入，否則易析出。（二）DTT易降解，因此要在Buffer滅菌后加入，并且在低溫保存。1Storage Buffer：（2L透析用）50mM TrisHCl（pH7.9）0.1mM EDTAK+50mM KCl0.5mM PMSF1mM DTT配法：1M TrisHCl（pH7.9） 100ml0.5M EDTAK+（pH7.9） 0.4ml1M KCl 100ml PMSF 0.1743g定容至1000ml，再加甘油1000ml。滅菌后加入過濾除菌的DTT。1M DTT過濾除菌后加入2ml。（3）挑斑搖菌5ml LB加Amp至80g/ml。2管（用同一個(gè)斑，并標(biāo)記該斑），37過夜。（本次試驗(yàn)中由20：309：30）第三天 酶的誘導(dǎo)表達(dá)（1）轉(zhuǎn)瓶：LB加Amp至80g/ml(即濃度為100mg/ml的Amp在1L的培養(yǎng)基中加800l)，加菌液500l/L，37搖菌。預(yù)計(jì)21：00可加IPTG誘導(dǎo)。Note：本次試驗(yàn)中由10：3020：00，OD550值達(dá)到1.663，應(yīng)在0.8左右最好。達(dá)到1.8亦可。（2）保存菌種：400l菌液加400l菌種保存液，-70保存。（3）清理器皿：檢查是否有未滅菌的器皿，將用過的器皿清洗滅菌。（4）測(cè)OD值，加IPTG（250mg/ml）至125mg/L（0.5mM。500l1L）37搖菌，12hr。Note:（一）誘導(dǎo)IPTG一般加到1mM，誘導(dǎo)時(shí)間相對(duì)較短，2mM為飽和值。本次試驗(yàn)將濃度降低，時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，以便過夜搖菌。（二）加IPTG前取樣（500l2）以備做蛋白膠對(duì)照。明早離心前再取樣預(yù)備跑蛋白膠。菌液離心后收集菌體4保存。（三）IPTG誘導(dǎo)12hr，明早8：00前要調(diào)水浴鍋至75（精確！）。同時(shí)離心轉(zhuǎn)子預(yù)冷至4。第四天 提Taq酶為避免污染，所有操作都要戴手套，常換手套和槍頭。（1）收集菌體：8：30離心，5000rpm，4，15min，500ml離心管2，收集兩次，共2L。Note：以下操作在冰上進(jìn)行，與制感受態(tài)類似。（2）洗滌：Add 100mlBuffer A per liter origin culture volume，轉(zhuǎn)至250ml離心瓶2；6000rpm，4，12min，冰上。（3）PreLysis：Add 50ml PreLysis Buffer per liter origin culture volume（先加50ml Buffer A per liter，充分懸浮，再加Lysozyme至4mg/ml，搖勻），室溫放置15min，合并至一個(gè)250ml離心瓶中。（4）熱變性沉淀雜蛋白：在Lysis Buffer中加入PMSF，待用。加入等體積的Lysis Buffer，轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，75，1hr。（5）除去沉淀：15000rpm或17000rpm（Beckman）4,15-20min。取上清，轉(zhuǎn)入干凈的三角瓶中，用滅菌的100ml量筒量取體積。（6）（NH4）2SO4沉淀Taq酶：用小燒杯稱取硫酸銨（按30g/100ml上清）在室溫慢加慢搖。邊加邊搖。本次試驗(yàn)搖了兩個(gè)小時(shí)。Note：（一） 避免局部鹽濃度過高導(dǎo)致Taq酶析出，要加一點(diǎn)搖一會(huì)。（二）搖燒杯時(shí)要注意不要產(chǎn)生泡沫，泡沫會(huì)使酶活性降低。（三）大約加入一半硫酸銨時(shí)溶液會(huì)渾濁，若沉淀出現(xiàn)太早表明雜蛋白未除盡，可在透析之后離心除去。（7）離心沉淀Taq酶：轉(zhuǎn)入50ml離心管，15000rpm或18500rpm（Beckman）室溫，25min。棄上清，沉淀重懸在5ml Buffer A per 100ml上清。Note：（一）若在4離心則沉淀很少。（二）上清可倒在三角瓶中多離心幾次便可以將沉淀完全離心下來。（8）透析：將透析袋用透析夾夾緊，透析袋中避免有氣泡，可用手將氣泡擠出（戴手套?。┟總€(gè)透析袋約10ml在Storage Buffer中加入DTT（切記?。┰?000ml燒杯中倒入約400500ml，放入磁轉(zhuǎn)子，4緩慢攪拌，每隔12hr換一次透析液。Note：（一）透析袋可多折幾次以免夾得不緊。（二）透析時(shí)燒杯要封口（可用PE手套）第五天 透析早晚各換一次透析液，原透析液倒掉，切勿造成酶的污染！Note：Storage Buffer平