DNA重組技術(shù)的基本步驟.ppt

1 2基因工程的基本操作程序 目的基因的檢測與鑒定 目的基因的獲取 基因表達載體的構(gòu)建 將目的基因?qū)胧荏w細胞 基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟 1 原核細胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 終止子 啟動子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶 能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì) RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點 并與其結(jié)合 轉(zhuǎn)錄開始后 RNA聚合酶沿DNA分子移動 并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA 轉(zhuǎn)錄完畢后 RNA鏈釋放出來 緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細胞基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列 包括啟動子和終止子 2 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 內(nèi)含子 外顯子 轉(zhuǎn)錄 mRNA前體 加工 翻譯 肽鏈 啟動子 終止子 成熟mRNA 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列 外顯子 內(nèi)含子 真核細胞的基因結(jié)構(gòu) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 外顯子 能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子 不能編碼蛋白質(zhì)的序列 有調(diào)控作用的核苷酸序列 包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 非編碼序列 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子 3 原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較 思考 編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì) 原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎 連續(xù) 不連續(xù) 編碼區(qū) 非編碼 閱讀與思考 1 什么是目的基因 2 獲取目的基因的方法有哪些 其操作過程分別是怎樣的 請閱讀P9第一和二兩段 1 目的基因概念 主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 2 目的基因獲取方法 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 化學(xué)方法直接人工合成 一 目的基因的獲取 從基因文庫中獲取目的基因 基因文庫 基因組文庫 部分基因文庫 基因文庫的構(gòu)建過程 將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷 導(dǎo)入到受體菌的群體中 各個受體菌分別含有這種生物的不同基因 稱為基因文庫 基因組文庫 cDNA文庫的構(gòu)建 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 目的基因的mRNA 單鏈DNA 反轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 雙鏈DNA 目的基因 基因文庫的構(gòu)建過程 真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎 有哪些差異 原核生物基因呢 思考 基因組文庫和部分基因組文庫 cDNA文庫 比較 怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢 如何從基因文庫中找到所需要的基因 依據(jù) 目的基因的有關(guān)信息 如 根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性 構(gòu)建基因組DNA文庫時 首先應(yīng)分離細胞的A 染色體DNAB 線粒體DNAC 總mRNAD tRNA 目的基因可從基因文庫中獲得 下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A 某生物的全套基因就是一個基因文庫B 將含有某種生物不同的許多DNA片段 導(dǎo)入某個生物體內(nèi) 則這個生物就是一個基因文庫C 含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D 含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫 A C 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 PCR的全稱 聚合酶鏈式反應(yīng)PCR的原理 DNA復(fù)制PCR技術(shù)擴增目的基因的前提條件 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列 選修3 P58 模板原料引物酶控制溫度 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 目的基因DNA 四種脫氧核苷酸 如單鏈DNA分子片段 使DNA聚合酶能夠從引物的3 端開始連接脫氧核苷酸 耐熱的DNA聚合酶 PCR儀自動調(diào)控 PCR的條件 過程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 d 重復(fù)a b c步驟 每重復(fù)一次 目的基因增加 倍 一 加熱至95攝氏度的目的是使DNA中的斷裂 這一過程在細胞內(nèi)是通過的作用來完成的 當(dāng)溫度降低時 引物與模板末端結(jié)合 在DNA聚合酶的作用下 引物沿模板延伸 最后合成2個DNA分子 此過程中的原料是 遵循的原則是 Taq酶的特點是 A 耐強酸B 耐強堿C 耐高溫D 最適溫度37攝氏度4 請指出PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程的區(qū)別 解旋酶 C 脫氧核苷酸 堿基互補配對原則 PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較 堿基互補配對原則 堿基互補配對原則 四種脫氧核苷酸 模板 酶 ATP 四種脫氧核苷酸 模板 酶 引物 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化解旋 半保留復(fù)制 邊解旋變復(fù)制 半保留復(fù)制 全解旋再復(fù)制 體外復(fù)制 主要在細胞核內(nèi) 大量的DNA片段 形成整個DNA分子 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 細胞內(nèi)的DNA聚合酶 解旋酶 DNA連接酶等 用化學(xué)方法直接人工合成 條件 基因較小 核苷酸序列已知 化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子 啟動子和終止子嗎 反轉(zhuǎn)錄法 目的基因的信使RNA 目的基因 化學(xué)合成法 肽鏈氨基酸序列 信使RNA序列 基因的核苷酸序列 目的基因 合成 人工合成法 真核生物 推測 推測 單鏈DNA 合成 2 下列屬于獲取目的基因的方法的是 利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 從基因組文庫中提取 從受體細胞中提取 利用PCR技術(shù) 利用DNA轉(zhuǎn)錄 人工合成A B C D 1 在已知基因的核苷酸序列的情況下 獲取目的基因的最方便方法是A 化學(xué)合成法B 基因組文庫法C CDNA文庫法D 聚合酶鏈反應(yīng) 3 在基因工程中 把選出的一個目的基因 共1000個脫氧核苷酸對 其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個 放入DNA擴增儀中擴增4次 那么 在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是 個 A 540B 8100C 17280D 7560 4 在遺傳工程中 若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG TACAC 要使其數(shù)量增多 可用PCR技術(shù)進行人工復(fù)制 復(fù)制時應(yīng)給予的條件是 雙鏈DNA分子為模板 ATGTG或TACAC模板鏈 四種脫氧核苷酸 四種核苷酸 DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 引物 溫度變化 恒溫A B C D D 5 下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是 從基因文庫中獲取目的基因 利用PCR技術(shù)擴增目的基因 反轉(zhuǎn)錄法 通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A B C D D 1 用一定的 切割質(zhì)粒 使其出現(xiàn)一個切口 露出 2 用 切斷目的基因 使其產(chǎn)生 3 將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的 處 再加入適量 形成了一個重組DNA分子 重組質(zhì)粒 限制酶 黏性末端 同一種限制酶 的黏性末端 切口 DNA連接酶 相同 1 過程 二 基因表達載體的構(gòu)建 核心 質(zhì)粒 目的基因 限制酶處理 一個切口兩個黏性末端 兩個切口獲得目的基因 DNA連接酶 表達載體 同一種 2 基因表達載體的組成 目的基因啟動子 終止子 標記基因等 一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段 位于基因的首端 一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段 位于基因的尾端 啟動子的作用 終止子作用 使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止 標記基因作用 是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細胞篩選出來 如青霉素基因 是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì) 3 基因表達載體的構(gòu)建目的 a 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 b 使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用 思考 作為基因工程表達載體 只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎 為什么 不可以 因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用 還需要有其他控制元件 如啟動子 終止子和標記基因等 必須構(gòu)建上述元件的主要理由是 1 生物之間進行基因交流 只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達 2 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子 只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄 3 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記 4 為了增強目的基因的表達水平 往往還要增加一些其他調(diào)控元件 如增強子等 5 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位 往往要加上可以標識存在部位的基因 或做成目的基因與標識基因的融合基因 如綠色熒光蛋白基因等 載體與表達載體的區(qū)別 二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段 表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子 終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞 必需以表達載體的方式攜帶進去 注意 目的基因與運載體結(jié)合所需的條件有 同一種限制酶 具有抗性基因的質(zhì)粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA連接酶 四種脫氧核苷酸 ATPA B C D 多選 一個基因表達載體的構(gòu)建應(yīng)包括A 目的基因B 啟動子C 終止子D 標記基因 ABCD D 下列關(guān)于基因表達載體的敘述不正確的是A 啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 是起始密碼B 啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段 對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C 標記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D 基因表達載體的構(gòu)建視受體細胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別 A 1 什么是轉(zhuǎn)化 2 目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ鞘裁?具體過程是怎樣的 3 目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ玫姆椒ㄊ鞘裁?基本操作程序是怎樣的 4 目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎樣的 鈣離子有什么作用 三 目的基因?qū)胧荏w細胞 轉(zhuǎn)化 目的基因進入受體細胞內(nèi) 并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程 三 目的基因?qū)胧荏w細胞 常用的受體細胞 原核生物 大腸桿菌 枯草桿菌 土壤農(nóng)桿菌真核生物 酵母菌和動植物細胞 將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理 借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑 1 目的基因?qū)胫参锛毎?常用的方法 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 農(nóng)桿菌的特點 c Ti質(zhì)粒上的T DNA可轉(zhuǎn)移到受體細胞 并整合到受體細胞染色體的DNA上 b 具有趨化性 a 易感染雙子葉植物和祼子植物 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 整合到染色體上 轉(zhuǎn)移至受體細胞 根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理 你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎 若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物 如小麥 從理論上說 你認為應(yīng)該怎么做 P15 2 思考與探究 因為單子葉植物不能分泌出大量的酚類化合物來吸引農(nóng)桿菌 向單子葉植物的傷口處噴灑酚類化合物 使用基因槍法及花粉管道法 2 基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法 是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力 將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中 使目的基因與其整合并表達的方法 1 常用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法 2 特點 成本高 3 花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后 花粉管要穿過花柱直通胚囊 花粉管通道法就是在植物受粉后 花粉形成的花粉管還未愈合前 剪去柱頭 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞 我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得 目的基因?qū)雱游锛毎?常用的方法 顯微注射技術(shù)操作程序 a 先提純含目的基因的表達載體b 從雌性動物體內(nèi)取出卵 受精卵 c 顯微注射儀進行顯微注射d 將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體 常用法 Ca2 處理 常用菌 大腸桿菌 3 目的基因?qū)胛⑸锛毎?原核生物的特點 繁殖快 多為單細胞 遺傳物質(zhì)相對較少 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程 用Ca2 處理細胞 感受態(tài)細胞 重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子 增加細胞壁的透性 與細胞膜無關(guān) 將目的基因?qū)胧荏w細胞 1 將目的基因?qū)胫参锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱游锛毎?顯微注射技術(shù) 3 將目的基因?qū)胛⑸锛毎?Ca2 處理 比較目的基因?qū)氩煌毎姆椒?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法 Ca2 處理法 體細胞 受精卵 原核細胞 1 基因工程中科學(xué)家常用細菌 酵母菌等微生物作為受體細胞 原因是A 結(jié)構(gòu)簡單 操作方便B 繁殖速度快C 遺傳物質(zhì)含量少 簡單D 性狀穩(wěn)定 變異少2 基因工程常用的受體細胞有 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動植物細胞A B C D B D 1 導(dǎo)入目的基因后需要檢測哪些方面 各采取什么方法 2 什么是DNA分子探針 檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應(yīng)的mRNA 3 利用抗體 抗原雜交檢測的原理是什么 四 目的基因檢測與鑒定 分子雜交技術(shù) 抗原 抗體雜交 DNA分子雜交技術(shù) 抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 DNA探針 用放射性同位素等作標記的含有目的基因的DNA片段 一 檢測 1 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 關(guān)鍵步驟 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記 以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 若顯示出雜交帶 表明染色體已插入染色體DNA中 1 方法 DNA分子雜交 2 過程 DNA分子雜交示意圖 采用一定的