「實(shí)體瘤組織單細(xì)胞懸液制備」.doc

實(shí)體瘤組織單細(xì)胞懸液制備及培養(yǎng)方案一、 單細(xì)胞懸液制備(一) 儀器、材料及試劑1. 儀器：(1) CO2培養(yǎng)箱（調(diào)至37），離心機(jī)，水浴鍋（37），血球計(jì)數(shù)板；(2) 無(wú)菌器械：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，50 ml離心管，平皿，吸管，移液管，紗布，200目/ 300目尼龍濾網(wǎng)，手術(shù)器械。2. 材料：腫瘤造模成功的大鼠3. 試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液/PBS緩沖液，碘酒附：Hanks液配方： KH2PO4 ：0.06g；NaCl：8.0g；NaHCO3：0.35g；KCl：0.4g；Glucose：1.0g； Na2HPO4H2O：0.06g；加H2O定容至 1000 ml注：Hanks液可以高壓滅菌，4下保存。(二) 操作步驟 機(jī)械-胰酶消化法1. 取材：制備實(shí)體瘤單細(xì)胞懸液，腫瘤取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，挑選活力較好的部位。將大鼠麻醉，置75%酒精泡3-5 min（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，以免酒精從口和肛門(mén)浸入體內(nèi)），固定后再用碘酒消毒腹部，帶入超凈臺(tái)內(nèi)解剖取腫瘤組織，置于平皿中。2. 用Hanks 液/PBS緩沖液洗滌三次，并剔除周?chē)?、結(jié)締組織、血液等。3. 用無(wú)菌眼科手術(shù)剪將腫瘤剪成小塊（1-2 mm），再用Hanks 液/PBS緩沖液洗滌三次，轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中。4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40 min，每隔5 min輕輕振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。5. 加入2-5 ml含血清培養(yǎng)基，以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6. 靜置2-3 min，使未分散的組織塊下沉，將懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。7. 用200/300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾懸液2次。8. 將過(guò)濾后懸液1000 rpm，離心5-10 min，棄上清液。9. 加入Hanks液/PBS緩沖液5 ml，輕輕沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。10. 視細(xì)胞量加入l-2 ml培養(yǎng)液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。11. 將細(xì)胞調(diào)整到5105 /ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37下培養(yǎng)?；蛘咧苯佑米髁魇椒治黾捌渌治?。二、 實(shí)體瘤組織中抗癌藥物含量檢測(cè)1. 按上述取材步驟取出合適的腫瘤組織，分成A、B兩份，分別置于含有1-2 ml PBS緩沖液的無(wú)菌離心管中（離心管及PBS液已稱(chēng)重），準(zhǔn)確稱(chēng)量腫瘤組織的重量。A組可直接用于檢測(cè)組織中抗癌藥物的含量，B組用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物含量。2. B組組織按照上述步驟制成單細(xì)胞懸液，制備過(guò)程中，保留每一次的PBS洗液（1-2 ml），標(biāo)記清楚，用于檢查含藥量。3. 將單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總量，檢查細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物含量。三、 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)(一) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)1. 腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞多為貼壁細(xì)胞，將剛分散的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶后，待4-5 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，此時(shí)可更換新的培養(yǎng)基，除去未能貼壁的細(xì)胞碎片及死細(xì)胞。2. 每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況，待細(xì)胞貼壁密度大于90%時(shí)，可用胰酶消化，按1:5比例進(jìn)行傳代到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，可根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整接種比例，或者取適量消化后進(jìn)行其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(二) 成纖維細(xì)胞的排除成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng)，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。1. 機(jī)械刮除法：是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序?yàn)椋?) 標(biāo)記：鏡下觀察，用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位；2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記空間；3) 用Hanks液/PBS緩沖液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；4) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止2. 反復(fù)貼壁法：根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。1) 待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks /PBS緩沖液沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；2) 取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；3) 培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞520分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。4) 當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶?jī)深?lèi)細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。3. 消化排除法：1) 先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。4. 膠原酶消化法：本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。1) 可用0.5 mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；2) 用Hanks/PBS緩沖液洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。四、 注意事項(xiàng)(一) 自取材開(kāi)始，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。(二) 在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久，以免溶液蒸發(fā)。(三) 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。四、 無(wú)菌操作的幾個(gè)注意事項(xiàng)(一) 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦拭。試劑等瓶口也要擦拭。(二) 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免退火，并冷卻后