藥代動力學研究方法.doc

中藥藥代動力學測定方法的研究概況日期：2010-08-27來源： 作者：字體：大 中 小 - 作者：陳慧慧，孫付軍，李貴海【摘要】 體內藥物濃度（主要是血藥濃度）的測定是研究藥代動力學的前提，中藥及其復方的藥代動力學又是中藥 現代 化的關鍵組成部分，所以體內藥物濃度測定方法的 發(fā)展 是每個藥代動力學研究者都應該關注的課題。隨著先進儀器的開發(fā)和使用，體內藥物測定方法取得了重大進步。該文綜述了近年來中藥藥動學血藥濃度分析的方法，包括分光光度法，色譜法，免疫法，同位素法和微生物法，并介紹了它們的優(yōu)缺點。 【關鍵詞】 分光光度法； 色譜法； 免疫法； 同位素法； 微生物法 中藥藥代動力學是近20年迅速發(fā)展起來的以中醫(yī)藥基本理論為指導，用藥物動力學方法研究中藥在動物或人體內的吸收、分布、代謝和消除過程的一門新興邊緣學科。血藥濃度法1是藥物動力學研究的經典方法，是 計算 藥代動力學最常用最準確的測定方法，所以血藥濃度準確的測定是中藥藥代動力學研究至關重要的環(huán)節(jié)。先進的測定方法是精確測定的前提，發(fā)展更先進、更合適的測定方法是中藥面向現代化、面向世界的必經之路。 1 利用原子和分子對不同激發(fā)光譜的吸收特性，來鑒別確定指標成分 1.1 分光光度法2包括紫外-可見分光光度法，熒光分光光度法及原子吸收光譜法。分光光度法儀器設備簡單、投資少、成本低、操作方便，只要有一定吸收光譜的物質均能測得。曹蔚等3人用紫外分光光度法測定紅花黃色素在家兔體內的藥代動力學，結果表明：紅花黃色素在健康家兔體內為一室模型，主要藥動學參數：曲線下面積（AUC）為40 192.6gmin-1ml-1，半衰期為44.0min，消除速率常數為0.016/min，腎清除率為1.22ml/min。但分光光度法靈敏度較低，對體內許多內源性物質難以區(qū)分，所以分光光度法常與色譜法聯用，目前紫外分光光度法和熒光分光光度法被廣泛用作高效液相色譜儀的檢測手段。1.2 色譜法包括薄層層析法、薄層掃描法、氣相色譜法、氣相-質譜聯用，高效液相色譜法（單維、二維、三維、熒光）液相-質譜聯用。色譜法尤其是高效液相色譜法，經過多年發(fā)展已趨于完善，其穩(wěn)定性、可操作性、準確性、靈敏度均有了較大的提高，成為色譜法的代表。1.2.1 薄層層析法層析法是分析研究中最常用的分離手段，薄層層析是層析分離中應用最為普遍的方法之一。周繼紅等4用HP-TLC法測定了血清中大黃有效成分的含量。薄層層析分離效率高，不易受溶劑和雜質的干擾，其缺點是線性范圍較窄，操作技術要求較高。1.2.2 薄層掃描法薄層掃描法系指用一定波長的光照射在經薄層層析后的層析板上，對具有吸收或能產生熒光的層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。對于中成藥復方制劑，亦可用相應的原藥材按需要組合作陰、陽對照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。使用儀器為薄層掃描儀。賀浪沖等5用固相萃取-薄層掃描法測定兔血清中青藤堿濃度，他們用自制硅膠萃取柱及萃取儀，將血清中青藤堿凈化后，點樣于硅膠G硅膠GF254（21）薄層板上，以氯仿甲醇（192）為展開劑，在島津CS-930上，用雙波長（S275nm ,R320nm）鋸齒法掃描測定。結果表明：血清中青藤堿的固相提取回收率為（96.957.59）%，用薄層掃描法測繪了兩只家兔靜注青藤堿后的藥物濃度-時間曲線，青藤堿的薄層掃描測定法靈敏、準確。1.2.3 氣相色譜法（GC）GC是一種高效能、高選擇性、高靈敏度、操作簡單、應用廣泛的分離分析方法。在生物堿的血藥濃度測定方面應用較多，如郭軍等6用GC-FID法測定人含服速效救心丸后血中冰片、川芎嗪含量。不同時間點取健康志愿者含服速效救心丸后的血漿并分別測定其冰片、川芎嗪濃度，經3P97軟件處理數據得其藥動學參數。測得健康人血漿中兩種成分線性范圍為20420 ng/ml，線性關系良好，健康人含服速效救心丸后血漿中體內藥時過程符合開放性一室模型，吸收、分布、排泄較為迅速。但GC法受樣品揮發(fā)性的限制，實際應用的比例很小。1.2.4 氣相-質譜聯用（GC-MS）GC-MS聯用分析的靈敏度高、特異性強、實驗簡單高效，適合于低分子化合物分析，尤其適合于揮發(fā)性成分的分析，特別在中藥揮發(fā)性成分的鑒定等方面。如楊赴云等7用氣相- 質譜聯用法測定大耳白兔中銀杏內酯的血藥濃度，計算其藥代動力學參數，結果表明：大耳白兔靜脈注射銀杏內酯A、B后代謝符合二房室模型。1.2.5 高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）是在20世紀60年代末期，在經典液相色譜法和氣相色譜法的基礎上發(fā)展起來的新型分離分析技術，其采用高效固定相，以高壓輸送流動相，并配有各種檢測器，使分離與測定組成一個統(tǒng)一系統(tǒng)。HPLC法具有適用范圍廣、分離效能好、分析速度快、流動相可選擇范圍寬、靈敏度及特異性高、高度自動化等優(yōu)點，自20世紀80年代用于中草藥藥代動力學研究以來，現已成為中藥藥代動力學研究的主要手段8。其中反相高效液相色譜因條件溫和、分離度好、適應性廣、樣品前處理簡單、靈敏度高等優(yōu)點，在實踐中被廣泛應用。一般應根據目標成分選擇不同的檢測器，最常用的是紫外-可見光譜檢測器，若采用電化學或質譜作檢測器則可使靈敏度提高幾個數量級，但儀器過于昂貴限制了使用。 如李向陽等9采用 RP-HPLC法測定大鼠血漿中龍膽苦苷藥物濃度，色譜柱為 Lichrospher C18（4.6 mm250 mm，5 m），流動相為甲醇-水（3367,V/V），結果表明：在120 mg/L范圍內龍膽苦苷峰面積與濃度線性關系良好（r=0.999 7），最低可定量濃度為0.03 mg/L，絕對回收率為88.4%96.2%，準確度為97.8%104.9%，日內、日間RSD均小于10%。Kontani A等10用HPLC-ED測定大鼠體內黃芩苷和黃酮的血藥濃度，結果顯示黃芩苷和黃酮的血藥濃度與注射劑量分別在2.2 pg4.5 ng，1.4 pg2.7 ng范圍內線性關系良好。 孟憲生等11采用HPLC-FLU法研究家犬血漿中羌活提取物異歐前胡素的藥代動力學，采用藥代動力學軟件DAS（ver2.0）處理，得到異歐前胡素的藥代動力學參數。色譜柱為Phenomenex ODS（4.6 mm250 mm）；流動相為乙腈-0.025 mol/L磷酸水溶液（11）；流速為1.0 ml/min；熒光檢測Ex=310nm，Em=480nm。結果表明：異歐前胡素在家犬體內的代謝過程符合一室模型，吸收消除較快。1.2.6 高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）HPLC-MS聯用是將高效液相色譜儀與質譜儀用界面連接成一個完整的儀器,實現在線檢測12。HPLC-MS法具有高度的專屬性，對多數藥物的檢測靈敏度超過其他分析方法，使定量測試速度顯著加快，可以對混合物中的微量組分進行分析，已成為藥物分析中的主流技術。如張蕾等13用HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的濃度及其藥代動力學，血漿樣品經氯仿液-液萃取后，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（10:90）為流動相，用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm150 mm，5m）分離，采用電噴霧離子化源（ESI）單重四極桿串聯質譜，以選擇離子檢測（SM）方式進行檢測。該法快速、靈敏、專屬、適用于同時測定生物樣本中苦參堿、氧化苦參堿和氧化槐果堿的血藥濃度。 HPLC-MS聯用法對不同的藥物分子，隨著離子化程度的難易其檢測靈敏度存在很大差異。對有機堿藥物的靈敏度最高定量限可達ng/ml或更低；對酸性、中性藥物的靈敏度依次降低；對烴類化合物則沒有信號響應，這是該法應用的最大局限14。2 免疫分析法 免疫分析法的基礎是免疫反應，即抗原與抗體結合，形成抗原抗體結合物。這種結合是疏松、可逆的，利用樣品中待測藥物與標記藥物之間的競爭，使標記藥物從標記的抗原抗體結合物上被取代，其取代量與加入的待測藥物的量相關，通過測定被取代的標記藥物來定量分析待測藥物。主要包括放射免疫法和酶聯免疫法。免疫法有較高的靈敏度和準確性，操作簡單，適用于對大分子物質的檢測，但對于許多內源性相似物質的辨別能力有待提高。曲靜偉等15采用自動熒光偏振免疫法測定血清中地高辛的濃度，結果表明：在成年患者中84.6%例次的血清地高辛濃度在有效 治療 范圍（0.52.0 ng/ml），7.5%例次超過中毒濃度，7.9%例次低于最低有效濃度?？梢缘玫綄τ谀I功能正?；蚧菊５某赡昊颊?，地高辛的日劑量不宜大于0.25 mg/d。2.1 放射免疫法（RIA）放射免疫法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應的方法，研究機體對抗原物質反應的發(fā)生、 發(fā)展 和轉化 規(guī)律 。RIA靈敏度高，專一性強，取樣量少，簡單易行，可廣泛用于體液及組織微量激素、蛋白質、維生素和藥物等的測定。在中藥藥代動力學的測定中也有較好的應用。如劉曙光等16應用了放射免疫測定法來測定口服黃夾次苷甲、乙和黃夾苷后的藥代動力學。2.2 酶聯免疫法（EIA）17EIA由于標記物的多樣性，使其應用范圍更廣且無同位素污染。在均相酶免疫測定中，因不需分離使操作更方便、快速，廣泛用于抗生素、抗癲癇藥、平喘藥、心血管系統(tǒng)藥等多種藥物的測定和藥物濫用的監(jiān)測。 3 同位素標記法 同位素標記法（Isotopic tracer method）是利用放射性核素（或穩(wěn)定性核素）作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法。同位素示蹤所利用的放射性核素（或穩(wěn)定性核素）及它們的化合物，與 自然 界存在的相應普通元素及其化合物之間的化學性質和生物學性質是相同的，只是具有不同的核物理性質。因此，就可以用同位素作為一種標記，制成含有同位素的標記化合物（如標記食物，藥物和代謝物質等）代替相應的非標記化合物。3.1 放射性同位素標記法利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質，就可以用核探測器隨時追蹤它在體內或體外的位置、數量及其轉變等，放射性同位素與其它測定方法聯用可以很好的完成中藥代謝產物在體內的血藥濃度測定。用放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏，測量方法也簡便易行，能準確地定量，定位且符合所研究對象的生理條件等特點，但放射性同位素法對環(huán)境有污染，因而實際應用較少。3.2 穩(wěn)定性同位素標記法穩(wěn)定性同位素雖然不釋放射線，但可以利用它與普通相應同位素的質量之差，通過質譜儀，氣相色譜儀，核磁共振等質量分析儀器來測定。但穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑其靈敏度較低，可獲得的種類少，價格較昂貴，其應用范圍受到限制。 4 微生物法18 具有抗菌活性的中藥復方制劑，如黃連解毒湯、清瘟敗毒飲、大黃牡丹皮湯劑等，可以利用微生物法測定體液樣品的濃度，然后擬合模型 計算 藥代動力學參數。潘嘉等19采用抑菌效應法測定川芎揮發(fā)油藥動學參數，結果表明：川芎揮發(fā)油的藥動學過程符合一室開放模型。 上述測定方法多是對中藥有效成分的血藥濃度測定，在某些情況下，有效成分可以代表中藥復方，但大多數情況下中藥復方中的成分復雜且不清楚，單一成分不能完全代表其作用?，F在有很多人測定多種單體成分的血藥濃度以避免脫離中醫(yī)藥整體觀念思想，但是這種方法耗時耗力也并不一定能代表所有成分。為了更好的研究中藥復方的藥動學，中外學者提出了很多假說20，比較有代表性的有“證治藥動學”新假說21，“復方效應成分動力學”新假說22，“辨證藥動學”假說17，“中藥胃腸藥動學”17和“血清藥 理學 ”23等。但這些假說都比較片面，不能全面的說明問題。 研究中藥制劑的藥動學是中醫(yī)藥發(fā)展的趨勢，對推動中醫(yī)藥學科的發(fā)展，促進中藥 現代 化和中藥走向世界具有極為重要的意義。為了能更好地為中藥藥代動力學服務，發(fā)展更高效、更靈敏的測定方法勢在必行?！?參考 文獻 】 1李躍輝,楊永華.中藥藥代動力學研究方法進展J.湖南中醫(yī)雜志，2004,20(2):66.2厲將斌,李海松,張 壯.中藥藥代動力學研究方法評述J.北京中醫(yī)藥大學學報,2002,25(6):51.3曹蔚,李教社,宋玉喬,等.紅花黃色素在家兔體內的藥代動力學J.陜西中醫(yī)學院學報,2002,25(1):53.4周繼紅,袁倚盛,楊俊偉,等.高效薄層色譜法測定血清中大黃有效成分的含量J.藥物分析雜志,1995,15(6):36.5賀浪沖,張阿慧,朱周才,等.固相萃取-薄層掃描法測定血清中青藤堿濃度J. 中國 藥學雜志,1997,32(2):110.6郭 軍,黃 熙,王驪麗,等.GC-MSD法同步測定人含服速效救心丸后血中冰片、川芎嗪含量J.中草藥,2003,34(8):730.7楊赴云,王景田,金有豫.銀杏內酯A、B在家兔體內的藥代動力學研究J.中國藥學雜志,2000,35(8):541.8李淑芳,吳秀君.HPLC法在中藥藥代動力學中的應用J.實用藥物與臨床,2008,11(1):36.9李向陽,蘇效東.大鼠血漿中龍膽苦苷的檢測J.青海醫(yī)學院學報,2004,24(1):12.10Kotani A,Kojima S,Hakamata H,et al.HPLC with electrochemical detection to examine the 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