「酸溶蛋白和粗蛋白測(cè)定」.doc

油 脂 的 檢 驗(yàn) 與 分 析粗蛋白質(zhì)的測(cè)定（凱氏半微量定氮法）測(cè)定原理 凱氏法的基本原理是將含有蛋白質(zhì)的樣品與濃硫酸共熱使其分解，其中氮元素變成銨鹽。再經(jīng)濃堿液作用，放出的氨氣經(jīng)硼酸吸收后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸溶液所吸收的氨。計(jì)算出試樣含氮量，乘以相關(guān)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得打蛋白質(zhì)的含量。 消化：蛋白質(zhì)與濃硫酸混合加熱，蛋白質(zhì)被炭化分解，其中碳被氧化成二氧化碳，所含的氮?jiǎng)t轉(zhuǎn)變成硫酸銨殘留于消化液中。 有機(jī)物（含N、C、H、O、P、S等元素）+H2SO4CO2 (NH4)2SO4H3PO4SO2SO3由于上述反應(yīng)進(jìn)行的很慢，消化需要很長(zhǎng)時(shí)間，加入催化劑可加速反應(yīng)。硫酸銅是備用的催化劑，硫酸鉀能提高硫酸的沸點(diǎn)，常將它們混合使用，起加速氧化、促進(jìn)有機(jī)物分解的作用。蒸餾：消化所得的硫酸銨加堿蒸餾，氨就被釋放出來(lái)。 (NH4)2SO4 2NaOH2 NH3H2O Na2SO4 NH3H2ONH3H2O生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后，指示劑顏色變化，再用鹽酸滴定，直至恢復(fù)到原來(lái)的氫離子濃度為止，鹽酸與樣品中氨是等摩爾反應(yīng)。 2NH34 H3 BO3(NH4)2 B 4O75H2O (NH4)2 B 4O72 HCl 5H2O 2NH4Cl 4H3 BO3 由于各種蛋白質(zhì)的含氮量通常為16左右，將含氮量乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為粗蛋白質(zhì)含量。試劑 濃硫酸過(guò)氧化氫水混合液（231）。在100mL水中緩慢加入濃硫酸200mL，冷卻后加入30過(guò)氧化氫300mL，混勻備用，此液存放陰涼處可保存一個(gè)月?；旌洗呋瘎?。10g硫酸銅（Cu SO45H2O）、100g硫酸鉀、0.2g硒粉，在研缽中研細(xì)，通過(guò)孔徑0.45mm篩，混勻后備用。40g/100mL氫氧化鈉溶液、2硼酸溶液、0.01mol/L鹽酸溶液。甲基紅乙醇溶液：稱(chēng)取0.1g甲基紅置于研缽中，加入少許95乙醇，研磨溶解后加入75mL95乙醇。次甲基藍(lán)乙醇溶液：0.1g次甲基藍(lán)溶于80mL95乙醇中，臨用時(shí)將以上兩液按2：1比例混合即成。在酸域呈紫紅色，PH5.5時(shí)無(wú)色，在堿域呈綠色。儀器 50mL凱氏燒瓶、1000mL圓底燒瓶、100mL錐形瓶、5mL(刻度0.01mL)微量滴定管、50mL容量瓶、5mL移液管、凱氏蒸餾裝置。操作方法 消化。用長(zhǎng)條光滑紙稱(chēng)取試樣0.20.3g，精確到0.0001g（約含粗蛋白質(zhì)1030mg）直接送入凱氏燒瓶底部，加混合催化劑1g，同時(shí)加入硫酸過(guò)氧化值水混合液35mL，稍加振搖，斜置于電爐上。在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱進(jìn)行消化。開(kāi)始時(shí)用低溫加熱，切勿使瓶中泡沫超過(guò)瓶肚的2/3，待泡沫減少和煙霧變白后再增加溫度保持微沸。直至消化液呈淺藍(lán)綠色的透明狀時(shí)再繼續(xù)加熱沸騰10min，取出，待消化液冷卻至室溫后，加水至1020mL。溶液溫度降到室溫后，將消化液移入50mL容量瓶中，并用少量水將凱氏燒瓶沖洗34次，洗滌液一并移入容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻備用。蒸餾。凱氏微量蒸餾裝置它是由蒸汽發(fā)生器、反應(yīng)瓶、及冷凝管等組成，在大燒瓶8（容量1000 mL）中加入蒸餾水400mL和少量碎玻璃片，加5滴混合指示劑，加幾滴酸液，使水呈紫紅色，蓋緊瓶塞，連接4、1、2并檢查有無(wú)漏氣。量取30mL2硼酸溶液，注入（100mL）三角瓶3內(nèi)，作為承接器，加混合指示劑12滴（溶液呈紫紅色），置于冷凝管2下面，使管尖端插入硼酸溶液1cm深處。用5mL移液管吸取5mL（V）試樣稀釋液，由漏斗5注入蒸餾瓶1內(nèi)，再倒入蒸餾水10mL沖洗漏斗5。接著量取40g/100mL氫氧化鈉溶液10mL，由漏斗5注入蒸餾瓶1內(nèi)，再用25mL水沖洗漏斗5，旋緊活塞，此時(shí)蒸餾瓶1內(nèi)溶液總體積應(yīng)不超過(guò)容積的一半。打開(kāi)電爐加熱燒瓶8，打開(kāi)簧夾7，關(guān)閉活塞6，使蒸汽通過(guò)回流管4進(jìn)入蒸餾瓶1再由蒸餾瓶1經(jīng)冷凝管2而流入三角瓶3，待三角瓶3內(nèi)的溶液呈綠色時(shí)，開(kāi)始記錄時(shí)間，經(jīng)23min后,將三角瓶3放低，使冷凝管2下端離開(kāi)液面，繼續(xù)蒸餾1min，然后用少量無(wú)CO2蒸餾水沖洗冷凝管2下端，蒸餾即告結(jié)束。蒸餾結(jié)束后，旋緊簧夾7斷絕蒸汽。這時(shí)由于回流管4內(nèi)蒸汽壓立即降低，所以蒸餾瓶1內(nèi)的液體則全部吸入回流管4內(nèi)。然后打開(kāi)漏斗5下的簧夾，注入蒸餾水4050mL于蒸餾瓶1內(nèi)，關(guān)閉漏斗5下的簧夾，打開(kāi)簧夾7，通入蒸汽加熱洗滌蒸餾瓶1，再斷絕蒸汽，使洗滌回流至回流管4中，打開(kāi)活塞6，將回流管4中廢液棄去，關(guān)閉活塞6，為下次蒸汽做好準(zhǔn)備。滴定。用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定三角瓶3中的吸收液至出現(xiàn)淡紫色為止。記錄所消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（V1）?？瞻自囼?yàn)除不加試樣外，消化、蒸餾、滴定操作與樣品相同。結(jié)果計(jì)算 粗蛋白質(zhì)的干基含量按下式計(jì)算： （V2V1）c0.01406.25 W（）100Vm V 式中V2-滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積，mL； V1-滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積，mL； c-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L； m-試樣的質(zhì)量，g； V-試樣分解液總體積，mL；V-試樣分解液蒸餾用體積，mL；0.0140-與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液c（HCl）1.000mol/L相當(dāng)?shù)囊钥?