二惡英檢測(cè)分析方法比較.doc

二惡英檢測(cè)方法比較二惡英化合物（簡稱二惡英）是劇毒有機(jī)污染物。人體長期低劑量接觸，會(huì)導(dǎo)致癌癥、雌性化、胎兒畸形、糖尿病等疾病。自比利時(shí)發(fā)生二惡英食品污染事件和POPs公約在瑞典斯德哥爾摩簽署以來，二惡英檢測(cè)與污染防治在國際上受到越來越廣泛的關(guān)注1。二惡英檢測(cè)屬超痕量、多組分檢測(cè)，對(duì)特異性、選擇性和靈敏度要求極高，被認(rèn)為是當(dāng)代化學(xué)分析領(lǐng)域的一大難點(diǎn)。美國較早開展二惡英檢測(cè)研究，現(xiàn)已制定出一系列的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。歐洲和日本也相繼研究和制定了二惡英檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。我國目前正處于二惡英基礎(chǔ)研究的起步階段，尚未提出相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此亟待建立符合我國國情的二惡英檢測(cè)方法和體系。2二惡英檢測(cè)方法2.1化學(xué)儀器分析方法在200余種異構(gòu)體中分離出17種有明顯毒性的二惡英 ，分別測(cè)定其濃度或含量。將濃度或含量乘以每種二惡英的毒性因子（TEF）就可以得到總毒性當(dāng)量（TEQ）。該方法的一般程序包括采樣、提取、凈化、定性定量。2.1.1采樣樣品的取樣量由樣品類型、污染水平和方法的檢測(cè)限而定。各國對(duì)采樣程序都單獨(dú)編制了標(biāo)準(zhǔn)方法。2.1.2 提取 為了測(cè)定提取凈化效率和校正分析丟失，首先加入17種13CPCDD/Fs采樣內(nèi)標(biāo)和37Cl2,3,7,8TCDD凈化內(nèi)標(biāo)。溶劑選擇和提取步驟取決于樣品類型和凈化方法，如在處理廢棄物焚燒飛灰時(shí)溶劑選取石油醚/甲苯/二氯甲苯，在處理脂肪樣品時(shí)溶劑選取二氯甲烷/己烷。提取步驟一般包括溶解、振蕩、混勻和萃取。索氏萃取是傳統(tǒng)的提取方法，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)飛灰、魚、牛乳和脂肪組織樣品中的二惡英。目前，超臨界流體萃取裝置（SFE）、加壓加熱型的高速溶劑萃取裝置（ASE）和微波萃取方法也用于提取樣品中的二惡英，并有大量對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明了這些方法的有效性3,4。2.1.3 凈化為了除去大量干擾物質(zhì)，目前大多采用色譜法進(jìn)行凈化。色譜法通常將分配處理柱和色譜柱串聯(lián)使用，包括酸或堿處理、硅膠柱、氧化鋁柱、佛羅里柱和活性炭柱的二次凈化，具體操作因樣品類型和基質(zhì)性質(zhì)而異。目前，一些實(shí)驗(yàn)室正在開發(fā)一次性多層柱（如微型氧化鋁柱）和HPLC凈化方法來簡化凈化過程。凈化后要加入15種13CPCDD/Fs定量內(nèi)標(biāo)和2個(gè)13C標(biāo)記的用于確定色譜保留時(shí)間的內(nèi)標(biāo)5。2.1.4定性定量 通常定性檢測(cè)采用2類不同極性的色譜柱。首先用非極性或弱極性固定相將氯原子取代數(shù)相同的二惡英化合物分為1組，然后用極性固定相分離其中的異構(gòu)體，最后通過對(duì)17 種標(biāo)記的和未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)施比較，獲取保留時(shí)間。定量檢測(cè)主要采用選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)（SIM），以13C穩(wěn)定同位素為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)測(cè)量目的用質(zhì)量校正程序校正質(zhì)譜模式、分辨率（M/M=10,000以上，10谷峰）等，并儲(chǔ)存質(zhì)量校正結(jié)果。對(duì)氯不同取代程度的異構(gòu)體分別定量。儀器可選擇高分辨質(zhì)譜儀（HRMS）、四級(jí)桿低分辨質(zhì)譜儀（LRMS）。2.2生物學(xué)檢測(cè)方法目前建立的生物學(xué)檢測(cè)方法均是通過對(duì) Ah受體活化程度的測(cè)定來間接表達(dá)二惡英的TEQ。2.2.1EROD細(xì)胞培養(yǎng)法二惡英與Ah受體結(jié)合活化后，被Ah受體核轉(zhuǎn)位因子（ARNT）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，活化的核內(nèi)基因是特異性DNA片段即二惡英響應(yīng)因子（DRE）。啟動(dòng)發(fā)揮毒性的基因并增加其轉(zhuǎn)錄，從而激活EROD酶的活性。所以通過測(cè)定EROD酶的活性，可以了解二惡英激活A(yù)h受體的能力，進(jìn)而獲得測(cè)試樣品中二惡英的 TEQ6。2.2.2螢光素酶方法該方法是將螢火蟲螢光素酶作為報(bào)告基因結(jié)合到控制轉(zhuǎn)錄的DRE上，制備成質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染H4IIE大白鼠肝癌細(xì)胞系（含Ah受體傳導(dǎo)途徑的各個(gè)部件）。以此構(gòu)成的CALUX系統(tǒng)螢光素酶誘導(dǎo)活性與二惡英 的毒性系數(shù)相對(duì)應(yīng)，最終測(cè)定的結(jié)果也是TEQ6。2.2.3 EIA酶免疫方法該方法是根據(jù)鼠單克隆抗體DD3與二惡英結(jié)合的特點(diǎn)而建立的競爭抑制酶免疫方法。使用酶競爭配合物（HRP）和樣品中二惡英共同競爭有限的DD3抗體的特異性結(jié)合位點(diǎn),以一系列不同濃度的 2,3,7,8TCDD為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作出2,3,7,8-TCDD標(biāo)樣與對(duì)應(yīng)樣品的劑量效應(yīng)曲線，樣品中二惡英毒性強(qiáng)度以計(jì)算出的TCDD毒性等價(jià)濃度間接表示。最終通過測(cè)定DD3與HRP螯合物的熒光強(qiáng)度來獲取二惡英的TEQ。螯合物的熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比7。2.2.4 DELFIA熒光免疫法DELFIA（Dissociation-enhancement Lanthanide Fluoro Immunoassay）法屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析法。該方法利用生物基因技術(shù)選擇出合適的抗原鍵合銪離子與樣品中二惡英競爭單克隆抗體，待免疫反應(yīng)完全后加入熒光增強(qiáng)液,使銪離子從抗原中解離下來，進(jìn)入增強(qiáng)液,形成膠束，高效地發(fā)出熒光。螯合物最終用時(shí)間分辨熒光法分析，其熒光強(qiáng)度與二惡英的TEQ成反比8。3二惡英檢測(cè)方法分析比較3.1 化學(xué)儀器檢測(cè)目前，HRGC/HRMS法是被認(rèn)可的二惡英標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，如美國的 EPA 1613方法和日本工業(yè)用的JIS K0311方法。它們具有檢測(cè)靈敏度高和能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)離子等優(yōu)點(diǎn)，但所要求的樣品前處理過程非常復(fù)雜，導(dǎo)致檢測(cè)成本上升，一般檢測(cè)1個(gè)樣品需要 9001800美元。檢測(cè)工作只能在少數(shù)專業(yè)化程度較高的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，而建造二惡英專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室一般需要投資數(shù)百萬美元以上。所有這些不利因素都制約著對(duì)二惡英開展大規(guī)模、大范圍的低成本檢測(cè)與研究。在實(shí)際檢測(cè)過程中，使用GC/HRMS法可保證靈敏度，簡化前處理步驟，縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)成本，但仍需在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中完成；使用HRGC/LRMS法可極大降低在檢測(cè)儀器方面的投入，但當(dāng)每克樣品中二惡英濃度低于pg/g水平時(shí)，卻無法獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。因而HRGC/LRMS法僅適用于檢測(cè)二惡英濃度較高的污染源樣品和污染較重的土壤樣品。例如，美國的EPA 8280方法可檢測(cè)出土壤、底泥、飛灰和燃油等樣品中含48個(gè)氯的二惡英化合物，不能用于檢測(cè)如食品等二惡英含量較低的樣品。3.2生物學(xué)檢測(cè)目前生物學(xué)檢測(cè)方法主要用于對(duì)二惡英樣品的定量篩選。研究表明，EROD法具有較好的準(zhǔn)確性和較寬的線性范圍，但測(cè)得的樣品TEQ略高于使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的結(jié)果 。螢光素酶方法在牛乳樣品二惡英檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比在檢測(cè)結(jié)果方面比較一致，說明該方法可用于食品樣品的二惡英毒性檢測(cè)。上述都屬于細(xì)胞培養(yǎng)法，檢測(cè)時(shí)需要配制各種濃度的細(xì)胞試液，一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)室不具備這樣的條件。而且培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)24h，整個(gè)檢測(cè)過程需要數(shù)日，不能滿足快速檢測(cè)的要求1。此外，EIA酶免疫方法與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，測(cè)得的TEQ值也比較一致，但靈敏度比較低。DELFIA法是一種最新的二惡英檢測(cè)方法,由于不需要細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)活化過程，體外活化時(shí)間僅需2h，因此1個(gè)批次樣品檢測(cè)可在8h內(nèi)完成，極大地提高了檢測(cè)效率。使用銪標(biāo)記抗原,采用時(shí)間分辨熒光技術(shù),可以消除非特異性熒光的干擾，使免疫方法的靈敏度大大提高。由于靈敏度的提高，檢測(cè)所需試樣量少，因此降低了檢測(cè)成本。一般1個(gè)樣品的平均檢測(cè)成本僅 1015美元。同時(shí)，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，大部分檢測(cè)工作均可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室甚至現(xiàn)場(chǎng)完成，無需建造專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的高成本投入，適于對(duì)大批量樣品實(shí)施快速定量篩選。4結(jié)論與建議以HRGC/HRMS法為代表的化學(xué)儀器分析方法具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其樣品前處理過程比較復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的專業(yè)化程度要求高，檢測(cè)時(shí)間長，檢測(cè)成本高，因而具有一定的應(yīng)用局限性，主要用于樣品規(guī)模較小、精度要求較高的專門檢測(cè)。與其相比，生物檢測(cè)方法的前處理過程比較簡化，樣品檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)成本低，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的專業(yè)化程度要求不高，但是其檢測(cè)靈敏度和精確度相對(duì)稍差，比較適用于大批量二惡英樣品的快速定量篩選。目前，我國的食品和環(huán)境安全正日益受到二惡英污染的威脅。因此應(yīng)結(jié)合實(shí)際需要，在滿足降低成本、提高效率的前提下，綜合利用各種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，盡快建立起能夠滿足定量篩選、常規(guī)檢測(cè)和認(rèn)證分析等不同要求、符合我國國情的多層次分級(jí)二惡英檢測(cè)體系。在該體系內(nèi)，低成本、快速的生物檢測(cè)方法可應(yīng)用于一般食品檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)，如定量篩選大規(guī)模的污染源樣品等。而一般的化學(xué)儀器分析包括 GC/HRMS法和HRGC/LRMS法，可應(yīng)用于對(duì)篩選出的樣品進(jìn)行較高精度的檢測(cè)。最后，可以通過建立幾個(gè)符合國際標(biāo)準(zhǔn)的二惡英專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，完成對(duì)二惡英檢測(cè)的權(quán)威認(rèn)證分析工作，這對(duì)推動(dòng)我國的二惡英基礎(chǔ)研究和污染防治工作將起到積極的作用。5參考文獻(xiàn)1吳永寧,王緒卿. 二惡英極其類似物對(duì)環(huán)境與食品污染. 中國食品衛(wèi)生雜志,1999,11（5）: 2733.2 田洪海,全浩. 固體廢棄物焚燒處理中二惡英的排放.環(huán)境科學(xué)研究,1998,11（3）: 57.3 Malisch R, Metschies M. 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