乙型肝炎病毒(HBV)實時熒光定量PCR.doc

乙型肝炎病毒（HBV）實時熒光定量PCR目的要求掌握 血清中HBV-DNA的提取方法及原理；HBV-DNA實時熒光定量PCR的測定原理； HBV-DNA實時熒光定量PCR實驗操作及結果分析了解 核酸測定引物設計原理；實時熒光定量PCR儀的工作原理及操作。教學時數(shù)講授2學時，實驗6學時。講授內容血清中病毒DNA的提取方法和原理；實時熒光定量PCR的測定原理；核酸測定引物設計原理；HBV-DNA測定引物設計思路；HBV-DNA熒光定量PCR試劑組成、相應作用及反應混合液配制；實時熒光定量PCR儀的工作原理及操作實驗內容分組提取血清中HBV-DNA；配制反應液并上機操作，實時觀察，結果分析；實驗結果討論；實驗總結自學內容“感染性疾病的分子診斷”實驗指導（自編） 實驗 乙型肝炎病毒（HBV）實時熒光定量PCR【原理】Real time PCR 是普通PCR 的一項改進，使用了針對擴增DNA 的熒光物質，使得DNA的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關系，大致得到DNA 的擴增曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。即對DNA靶分子的起始拷貝數(shù)進行定量的核酸檢測。該方法精確、靈敏、特異性強、污染途徑小、自動化程度高、操作簡單。是國際公認的核酸分子定量的標準方法。它已逐漸代替了Northern blotting 以及semi RT-PCR技術。本實驗從HBV攜帶者或者乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，采用核酸擴增結合TaqMan熒光探針技術, 利用一對乙肝病毒特異性引物和一特異性結合于擴增區(qū)另一位點的TaqMan探針, 實現(xiàn)對乙肝病毒模板的擴增和檢測。使用商品化試劑盒：HBV實時熒光定量試劑盒，深圳匹基公司（PG，Biotech.）。針對表面抗原S基因，設計一對引物和一個探針。TaqMan熒光探針技術中，兩個熒光染料標記在探針上，一個叫報告基團（R），一個叫淬滅基團（Q）。當兩個熒光基團都連在探針上時，報告基團的熒光被淬滅基團抑制。在延伸中，DNA聚合酶利用53外切酶活性把報告基團從探針上切下來。一旦和淬滅基團分開，報告基團釋放出熒光。通過監(jiān)測熒光信號的積累來反映乙肝病毒DNA的擴增.產物的積累，根據(jù)擴增反應的動力學特征使用外部標準曲線對初始模板定量（圖4）。 圖4：TaqMan熒光探針技術原理 R:熒光報告基團 Q：熒光淬滅基團【試劑與器材】1HBV-DNA檢測試劑盒：DNA提取液1，DNA提取液2，PCR預混合液（含有Mg2+、PCR反應緩沖液、dATP、dUTP、dGTP、dCTP引物、熒光標記的探針）、Taq酶、UNG，強陽性對照血清、陰性對照血清、臨界陽性血清，四種不同濃度的陽性參控品、雙蒸去離子水。2熒光定量PCR儀3PCR反應管4移液器及移液器吸頭5高速離心機6漩渦混合器7超凈工作臺8調溫電熱板【操作步驟】1. 試劑和主反應混合物的準備：從試劑盒中取出HBV PCR反應液、Taq酶及UNG。室溫融化后，2000rpm離心10sec，設需要的管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管強陽性對照+1管室內質控+1管試劑空白+4管陽性參控品），40ul測試反應體系配制如下表：試劑PCR反應液Taq酶UNG用量37.6ul0.4ul0.06ul計算好各試劑的使用量，加入一適當體積試管中，充分混合均勻，向設定的n個PCR反映管中分別加入38ul，轉移至樣本處理區(qū)。2. 樣本的制備和上樣（1）標本處理取n個0.5ml滅菌離心管，做好標記。首先加入100ulDNA提取液1，再分別加入待測血清或血漿樣本（切勿吸入血細胞）以及各種對照品各100ul，振蕩混勻，13000rpm離心10min：吸棄上清（離心時注意固定離心管方向，盡可能吸棄上清且不碰沉淀）；再加入25ulDNA提取液2，振蕩10sec（沉淀無需打散、混勻），100干浴，13000rpm離心10min，保留上清備用。如果樣本裂解產物當天不使用，則要保存在-20。（2）上樣若樣本及對照品裂解產物保存在-20，使用前置室溫解凍，以13000rpm離心5min。在所設定的n個反應管中分別加入步驟1中處理過的樣本、陰性對照、強陽性對照和室內質控血清、滅菌去離子水以及陽性參控品各2ul，蓋緊PCR反應管管蓋，并記錄樣本信息。3. PCR上機擴增檢查反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器；檢查并消除反應管底氣泡。按設置裝載反應管，選擇或設置擴增和檢測條件：選擇預設的程序文件或設置為：370C：3min；940C：1min；950C：5sec，600C：30sec，40個循環(huán)，熒光信號收集設在600C。設置模板：設置孔位及熒光（詳見相應儀器的操作手冊）。保存數(shù)據(jù)文件并運行。4. 結果分析（1）設置分析條件：設定基線：不同的PCR儀操作略有不同，按儀器說明書操作。PE7700:分析前把標準熒光定為TAMRA。如果沒有Ct16的強陽性樣品，應選315個循環(huán)的平均熒光信號作為基線再分析Ct；如果有Ct16的樣品，則將此樣品定為強陽性，并將此樣品從數(shù)據(jù)庫中剔除，然后以315個循環(huán)的平均熒光信號作為基線再分析Ct。ICycler：基線一般取自設值（210）。實驗結束后，點擊PCR baseline subtract選項扣除基線值。若某些曲線出現(xiàn)無規(guī)則的起伏跳動，應視為非正?，F(xiàn)象，此時將其從結果中剔除（點擊select wells,消除此孔彩色，然后選擇display wells）。注意調整坐標，使所有曲線都在坐標內，見圖5。LightCycler：用熒光顯示模式F1/F2讀取結果?；€設定原則以剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值時為準（一般定在0.0010.01范圍內，也可以根據(jù)儀器本身的實際情況加以調整）。域值設定：以剛好高于陰性對照品的擴增曲線最高點，且陰性對照品Ct=40或Ct=0為原則，調整起始域值。（2）實驗有效性判斷：檢查質控和標準品應同時符合下列條件，見圖5：（否則試驗視為無效）陰性對照、試劑空白CT值都為0強陽性對照和室內質控CT值不為0，且強陽性小于室內質控，拷貝數(shù)在105107間。標準品CT值小于38，且標準曲線斜率在-3.5 -4.0間，截距在40 50間，相關系數(shù)小于-0.98。A.B.圖5 實時熒光定量PCR結果分析E8, F8, G8, H8為標準品，D8為待測樣本，C8為陰性對照；A：基線、域值設置， B.：標準曲線5. 檢測結果的報告：檢測樣本中103copies/ml HBV DNA 5107copies/ml，可直接報告相應的拷貝數(shù)；檢測樣本中HBV DNA 103copies/ml時，均報告為 103copies/ml。檢測樣本中HBV DNA 為 0copies/ml時 ，報告為 5107copies/ml時，均報告為 5107copies/ml【注意事項】1操作中應使用不含熒光物質的一次性手套（經常更換）、一次性吸頭（最好帶濾芯），并不能用手直接接觸擴增管。2操作臺、離心機、移液器、PCR擴增儀等應定期用10%次氯酸鈉或70%酒精擦拭去污染。3熒光探針應避光保存，配制好反應液體系，應盡快上機擴增。4配置反應體系時，應注意移液器的使用方法，所有液體的混勻要使用振蕩器進行，不能用移液器吹打。5所有試劑開蓋前，應短暫離心。6配制反應體系過程中若需標記，請在試管或離心管架上標記，不要直接標記在擴增管上?！舅伎碱}】通常PCR有典型的變性-退火-延伸三個溫度點，為何本實驗擴增溫度循環(huán)只有兩溫度點：950C：5sec，600C：30sec，40個循環(huán) ？1.一般典型陽性的擴增曲線有對數(shù)生長期（熒光信號呈指數(shù)上升，曲線平直且有一定斜率），以及平臺期（熒光信號無明