蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離分析技術(shù).ppt

第六節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離分析技術(shù) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 一 兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)二 膠體性質(zhì)三 變性與復(fù)性作用四 蛋白質(zhì)的沉淀作用五 沉降作用六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)七 蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) 一 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈上存在游離的氨基和羧基 因此蛋白質(zhì)與氨基酸一樣具有兩性解離性質(zhì) 具有特定的等電點(diǎn) pI 溶液pH pI時(shí) 蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等 pH pI時(shí) 蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷 pH pI時(shí) 蛋白質(zhì)帶凈正電荷 等電點(diǎn)時(shí)特點(diǎn) 1 凈電荷為零 2 一定離子強(qiáng)度的緩沖液 等離子點(diǎn)特征常數(shù) 3 多數(shù)蛋白質(zhì)在水中等電點(diǎn)偏酸堿性AA 酸性AA等電點(diǎn)胃蛋白酶0 21 0血紅蛋白1 76 7細(xì)胞色素C2 910 7菊糖酶0 348 2 4 導(dǎo)電性 溶解度 黏度及滲透壓都最小 等電沉淀和蛋白電泳 遷移率與凈電荷量 分子大小 分子形狀等有關(guān) 帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳 electrophoresis 電泳 What selectrophoresis 一 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)分子在一定pH的溶液中可帶凈的負(fù)電荷或正電荷 故可在電場(chǎng)中發(fā)生移動(dòng) 不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不同 且分子大小也不同 故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同 據(jù)此可互相分離 一 蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點(diǎn) 二 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1 100nm 處于膠體顆粒的范圍 親水膠體 蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì) 布朗運(yùn)動(dòng) 丁道爾現(xiàn)象 不能透過(guò)半透膜 具有吸附力等 1 蛋白質(zhì)具有膠體溶液的性質(zhì) 二 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 2 穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水溶膠的兩個(gè)重要因素 水化膜 通過(guò)氫鍵與水結(jié)合表面電荷 在非等電點(diǎn)狀態(tài)下 雙電層 帶同性電荷蛋白質(zhì)分子互相排斥 蛋白質(zhì)顆粒的表面電荷和水化膜 3 蛋白質(zhì)凝膠凝膠作用 蛋白質(zhì)顆粒周圍的水膜是不均勻 使它們以一定的部位結(jié)合形成長(zhǎng)鏈 這些長(zhǎng)鏈又彼此結(jié)合成為復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠體 溶膠 蛋白質(zhì)作為分散相 水為連續(xù)相形成的溶液 凝膠 蛋白質(zhì)為連續(xù)相 水為分散相形成的網(wǎng)狀凝膠體 二 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 3 蛋白質(zhì)凝膠凝膠具有脹潤(rùn)作用 分類 1 可逆性凝膠 2 不可逆性凝膠部分破壞水化膜 適當(dāng)加熱和遠(yuǎn)離等電點(diǎn)4 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用滲析 透析 超濾 二 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 三 蛋白質(zhì)的變性 復(fù)性與凝固作用 在某些物理或化學(xué)因素的作用下 蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞 肽鍵不斷裂 一級(jí)結(jié)構(gòu)不變 從而引起蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的改變 稱為蛋白質(zhì)的變性 denaturation What sdenaturationofprotein 1 變性理論蛋白質(zhì)的變性就是天然蛋白質(zhì)分子中肽鏈的高度規(guī)則的緊密排列方式因氫鍵及其他次級(jí)鍵的破壞而變成不規(guī)則的松散排列方式 2 引起蛋白質(zhì)變性的因素 物理因素 高溫 高壓 紫外線 電離輻射 超聲波 機(jī)械攪拌 化學(xué)因素 強(qiáng)酸 強(qiáng)堿 有機(jī)溶劑 尿素 胍 重金屬鹽等 變性的因素及作用機(jī)制 物理性質(zhì) 旋光性改變 溶解度下降 結(jié)晶能力下降 沉降率升高 粘度升高 光吸收度增加等 化學(xué)性質(zhì) 官能團(tuán)反應(yīng)性增加 呈色反應(yīng)增強(qiáng) 易被蛋白酶水解 生物學(xué)性質(zhì) 原有生物學(xué)活性喪失 抗原性改變 變性蛋白質(zhì)的性質(zhì)改變 蛋白質(zhì)變性的可逆性 復(fù)性 某些蛋白質(zhì)變性后可以在一定的條件下重新形成原來(lái)的空間結(jié)構(gòu) 并恢復(fù)原來(lái)部分理化特性和生物學(xué)活性 這個(gè)過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性 renaturation 蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性 蛋白質(zhì)在體外變性后 絕大多數(shù)情況下不能復(fù)性 如變性程度淺 蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象未被嚴(yán)重破壞 或蛋白質(zhì)具有特殊的分子結(jié)構(gòu) 并經(jīng)特殊處理則可以復(fù)性 核糖核酸酶的變性與復(fù)性 天然構(gòu)象 蛋白質(zhì)變性的可逆性與復(fù)性 可逆變性 變性條件除去后仍可恢復(fù)天然狀態(tài)的變性 不可逆變性 變性條件除去后不能恢復(fù)天然狀態(tài)的變性 蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用 1 熱變性熱變性的定義熱變性三個(gè)階段影響熱變性的因素 溫度 砂糖 H 濃度 蛋白質(zhì)含水量 電解質(zhì) 蛋白質(zhì)的熱變性與凝固作用 2 蛋白質(zhì)的凝固作用天然蛋白質(zhì)變性后 變性蛋白質(zhì)分子互相凝集或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象成為蛋白質(zhì)的凝固 coagulation 凝固作用分兩個(gè)階段 首先是變性 其次失去規(guī)律性的肽鏈聚集纏繞在一起而凝固或結(jié)絮 蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用 理論上 研究蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能 分子量測(cè)定 亞單位拆分 生產(chǎn)生活中有利的一面 食品加工 消毒滅菌等 非蛋白生物物質(zhì)提取純化 終止酶促反應(yīng) 生產(chǎn)生活中不利的一面 活性蛋白制品 酶 抗體 的分離提取和保存 外加一些因素去除蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素后 使蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀 precipitation 1 What sprecipitationofprotein 變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團(tuán)的暴露而易于沉淀 但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì) 四 蛋白質(zhì)的沉淀作用 2 沉淀種類 可逆與不可逆 四 蛋白質(zhì)的沉淀作用 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法 2 沉淀種類 可逆與不可逆 四 蛋白質(zhì)的沉淀作用 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 1 鹽析 中性鹽沉淀法 2 有機(jī)溶劑沉淀法 3 酸沉淀法 1 鹽析 中性鹽沉淀 鹽溶作用鹽析作用 What ssaltprecipitationofprotein 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 1 鹽析 中性鹽沉淀 定義 在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽 以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出 稱為鹽析 saltprecipitation 作用機(jī)制 中和電荷的同時(shí)破壞水化膜 What ssaltprecipitationofprotein 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 常用的中性鹽 硫酸銨 氯化鈉 硫酸鈉等 鹽析時(shí) pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好 鹽析沉淀蛋白質(zhì)通常不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性 優(yōu)點(diǎn)鹽析應(yīng)用舉例 1 鹽析 中性鹽沉淀 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 分段鹽析 半飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較大的血漿球蛋白 而飽和硫酸銨溶液可沉淀分子量較小的血漿清蛋白 因此 使用不同濃度的硫酸銨溶液就可將分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分離 1 鹽析 中性鹽沉淀 凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑 如乙醇 甲醇 丙酮等 均可用于沉淀蛋白質(zhì) 沉淀原理 脫水作用 破壞水化膜 使水的介電常數(shù)降低 蛋白質(zhì)溶解度降低 2 有機(jī)溶劑沉淀法 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 處理?xiàng)l件 低溫操作 沉淀完全后盡快分離 2 有機(jī)溶劑沉淀法 蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法 機(jī)制 破壞電荷 等電點(diǎn)沉淀 3 酸沉淀法 1 重金屬鹽沉淀法 2 生物堿試劑沉淀法 除蛋白作用 3 熱凝固沉淀法 4 抗體對(duì)抗原蛋白質(zhì)的沉淀 3 沉淀方法 沉淀后蛋白質(zhì)仍能保持生物活性的沉淀方法沉淀后蛋白質(zhì)失去生物活性的沉淀方法 四 蛋白質(zhì)的沉淀作用 沉降的概念沉降速率 v dx dt沉降常數(shù)與單位應(yīng)用 沉降速度法測(cè)定分子量的原理 梯度離心分離蛋白質(zhì) 氯化銫 五 蛋白質(zhì)的沉降作用 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 1 雙縮脲反應(yīng)2 茚三酮反應(yīng)3 考馬斯亮藍(lán)G2504 福林酚試劑反應(yīng)5 黃色反應(yīng) 芳香族氨基酸的特有反應(yīng)6 米倫氏反應(yīng) 酪氨酸的特有反應(yīng)7 乙醛酸反應(yīng) 色氨酸的特有反應(yīng)8 坂口反應(yīng) 精氨酸特有的反應(yīng) 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 1 雙縮脲反應(yīng) 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用 生成粉紅色復(fù)合物含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物 能發(fā)生同樣反應(yīng)肽鍵的反應(yīng) 肽鍵越多顏色越深 粉紅 紫紅 藍(lán)紫受蛋白質(zhì)特異性影響小蛋白質(zhì)定量測(cè)定 測(cè)定蛋白質(zhì)水解程度 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 2 茚三酮反應(yīng)靈敏度差 3 考馬斯亮藍(lán)G 250本身為棕色 與蛋白質(zhì)反應(yīng)呈藍(lán)色與蛋白的親和力強(qiáng) 靈敏度高1 1000微克 毫升 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 4 福林酚試劑反應(yīng)酪氨酸 色氨酸的反應(yīng) 還原反應(yīng) 福林試劑 磷鉬酸 磷鎢酸與雙縮脲法結(jié)合 Lowry法在堿性條件下 蛋白質(zhì)與硫酸銅發(fā)生反應(yīng)蛋白質(zhì) 銅絡(luò)合物 將福林試劑還原 產(chǎn)生磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物靈敏度提高100倍 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 5 黃色反應(yīng) 芳香族氨基酸的特有反應(yīng)濃硝酸與酪氨酸 色氨酸的反應(yīng)生成黃色化合物指甲 皮膚 毛發(fā) 6 米倫氏反應(yīng) 酪氨酸的特有反應(yīng)酪氨酸的顯色反應(yīng) 酚羥基反應(yīng) 米倫試劑為硝酸 亞硝酸 硝酸汞 亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中 加入米倫試劑 產(chǎn)生白色沉淀 加熱后變成紅色 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 7 乙醛酸反應(yīng) 色氨酸的特有反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入HCOCOOH 將濃硫酸沿管壁緩慢加入 不使相混 在液面交界處 即有紫色環(huán)形成色氨酸的反應(yīng) 吲哚環(huán)的反應(yīng) 鑒定蛋白質(zhì)中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸 六 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 8 坂口反應(yīng) 精氨酸特有的反應(yīng)精氨酸的反應(yīng) 胍基的反應(yīng) 精氨酸與 萘酚在堿性次氯酸鈉 或次溴酸鈉 溶液中發(fā)生反應(yīng) 產(chǎn)生紅色產(chǎn)物鑒定蛋白質(zhì)中是否含有精氨酸定量測(cè)定精氨酸 七 蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì) 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸 酪氨酸和色氨酸 這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收 因此 大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收 可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量檢測(cè) 蛋白質(zhì)濃度 mg ml 1 45A280 0 74A260 蛋白質(zhì)的分離純化 一 分離純化的基本方法 1 鹽析與等電點(diǎn)沉淀 根據(jù)溶解度不同分離2 層析法離子交換層析法 根據(jù)電荷不同分離凝膠過(guò)濾法 根據(jù)分子量 分子形狀不同分離親和層析 根據(jù)特異性親和力不同分離3 梯度離心法 2 層析 層析 chromatography 是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異 在相互接觸的兩相 固定相與流動(dòng)相 之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法 What schromatography 主