不同基質(zhì)的中成藥及保健制品中鎮(zhèn)痛劑檢測方法的研究.doc

不同基質(zhì)的中成藥及保健制品中鎮(zhèn)痛劑檢測方法的研究項目完成單位：國家興奮劑及運動營養(yǎng)測試研究中心項目完成人： 吳筠 申力 楊聲 朱紹堂 吳侔天 陸江海摘 要 采用酸水解、SEP-PAK C18小柱固體萃取、反提、脫水及衍生化等手段從復(fù)雜的基質(zhì)中分離蛋白質(zhì)、多糖、油脂、植物油等干擾組分，提取出有效的鎮(zhèn)痛藥成分，用GC/MSD法對鎮(zhèn)痛類藥物進(jìn)行定性和定量分析。本方法從糖、膏基質(zhì)液中的提取平均回收率： 77.7%;茶和淀粉劑基質(zhì)中的提取平均回收率: 80.1%;蛋白粉中的提取平均回收率:78.5%;油類中的提取平均回收率72.5%;酒類中的提取平均回收率:77.2%,結(jié)果表明該方法提取率高,準(zhǔn)確、靈敏、可靠。1 引言 隨著科技的迅速發(fā)展和人民生活水平不斷地提高.怎樣增強(qiáng)免疫能力、強(qiáng)身健體、消除疼痛、疲勞和提高運動能力等已經(jīng)成為公眾關(guān)注的問題。近年來不斷有種類繁多的不同基質(zhì)的鎮(zhèn)痛保健制品推出。許多運動員也都在使用這些產(chǎn)品。經(jīng)過檢測研究，發(fā)現(xiàn)部分產(chǎn)品為了追求明顯的效果在產(chǎn)品中引進(jìn)某些動植物藥成份。這是我國衛(wèi)生部對于保健制品嚴(yán)令禁止的，并且也不符合國際奧委會的規(guī)定。開展這方面的研究,建立相應(yīng)的檢測方法，這對于保護(hù)消費者的合法權(quán)益和身體健康，尤其是少年兒童的身體健康，確保運動員在獲得良好的治療效果并提高運動能力的同時不出興奮劑問題，維護(hù)我國運動員在體壇特別是國際體壇的聲譽，有著十分重要的意義。目前，由于許多鎮(zhèn)痛的中成藥、保健制品都是一些含有糖、油脂、蛋白、動植物成分和軟膏劑基質(zhì)的產(chǎn)品，用現(xiàn)有的尿樣的分析方法難以有效分離，提取和回收率低。本課題在已有的研究基礎(chǔ)上，用酸水解、SEP-PAK C18小柱固體萃取、反提、脫水等手段從復(fù)雜的基質(zhì)中分離蛋白質(zhì)、多糖、油脂、植物油等干擾組分，提取出有效的鎮(zhèn)痛藥成分，用GC/MSD法對此類藥物進(jìn)行定性和定量分析。本方法已成功地用于2004年雅典奧運會運動員服用運動營養(yǎng)品的檢測。2 實驗部分2.1 儀器： Agilent 5973N-6890 GC/MSD, 質(zhì)量選擇檢測器，掃描范圍：50650。分析柱為HP-5 MS固定相為交聯(lián)甲基聚苯硅醚，長25m、內(nèi)徑0.2mm，膜厚0.33mm；C18固體柱（Water 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA)；電熱鼓風(fēng)干燥箱CS101-AB；三和松石混勻器；循環(huán)水式多用真空泵SHB-3。2.2 試劑： 甲醇、乙醚、正己烷、異丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯，碳酸氫鈉，碳酸鉀，氫氧化鈉都是北京化學(xué)試劑公司的產(chǎn)品，以上都是分析純試劑。半胱氨酸，MSTFA，MBTFA均是Sigma產(chǎn)品?；旌蠘?biāo)品液:準(zhǔn)確量取濃度為1 mg/ml的鎮(zhèn)痛新(pentazocine PE)、可卡因(cocaine CA)、美散痛(methadone ME)、嗎啡(morphine MO)、哌替啶(petidine PT)、可待因(codeine CD)、雙氫可待因(dihydrocodeine DH)、乙基嗎啡(ethylmorphine EM)、安儂痛(anadol AD)各10g,溶入5ml甲醇中。2.3 樣品制備：取50l混合標(biāo)品液，放入10ml螺口試管中，在60C氮氣下吹干，加入基質(zhì)，加水配成5ml溶液1。2.4 儀器條件：載氣:高純氦氣,流速為0.9mL/min(溫度為180C時)，分流進(jìn)樣，分流比為1:10，進(jìn)樣口溫度250C，接口溫度290C，離子源溫度230C，電子能量70eV，升溫程序:180C，以10C/min升至220C，又以5C/min升至260C，再以10C/min升至280C，保留10分鐘。2.5 樣品提?。?）含糖、膏基質(zhì)液:取上述溶液1，加入1.2g口服液或含糖顆粒沖劑基質(zhì)，加0.6 ml 12 mol/L氫氧化鈉溶液, 2g碳酸氫鈉:碳酸鉀(3:2 W/W)的固體緩沖劑2，混勻,調(diào)pH=10左右,用3mL 乙酸乙酯：異丙醇（9：1 V/V）3提取兩次，合并后濃縮至干后，用4ml 5% 醋酸溶解，用1g固體緩沖劑1，調(diào)pH=10左右，用4 mL三氯甲烷反提，加入無水硫酸鈉干燥，將有機(jī)層移至磨口錐形試管中，在650C氮氣下吹干。2）茶和淀粉劑基質(zhì)：取上述溶液1數(shù)份，分別加入0.2g上述基質(zhì)，加入2g固體緩沖劑2，調(diào)pH=9.6左右，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。在650C氮氣下吹干。3）補酒基質(zhì)：取上述溶液1，加入0.9g補酒，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去乙醇，再按樣品提取1提取。4）蛋白粉基質(zhì)：取上述溶液1，加至SEP-PAK C18小柱固體萃取，分別用5mL甲醇和水洗脫，洗脫液加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL濃鹽酸，在100C下水解30分鐘，冷至室溫。加3mL乙醚洗，棄去有機(jī)相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氫氧化鈉，混勻。加入2g固體緩沖劑2，混勻。再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,氮氣流下吹干。5）油狀基質(zhì)：取上述溶液，加100mg半胱氨酸，再加入0.5mL濃鹽酸，在100C下水解30分鐘，冷至室溫。加3mL乙醚洗，再用3mL正己烷洗，棄去有機(jī)相，向水相中加入0.6mL 12 mol/L氫氧化鈉，混勻。加入2g固體緩沖劑2，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,氮氣流下吹干。2.6 衍生化： 在殘渣中加入MSTFA 100mL，振蕩，在70C下反應(yīng)10分鐘。加入MBTFA 30mL，在70C下反應(yīng)10分鐘。轉(zhuǎn)移至衍生化小瓶中，進(jìn)2mL于GC/MSD。3 結(jié)果與討論方法的回收率: 1）對照樣品的制備：準(zhǔn)確量取濃度為1 mg/ml的 PE、CA、 methadone、 MO、PT、CD、DH、 EM、AD各10g兩份,吹干，各加入5mL空白尿，加入2g固體緩沖劑2，再加入3mL提取液3，振蕩10分鐘，離心5分鐘。冷凍分層后棄去水相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。2）同時取5個兩份空白尿按不同的5種方法提取后,有機(jī)相中分別加入0.5mL對照樣品,吹干,衍生化(1,2); 3）在5份兩個試管中分別加對照樣品0.5mL, 氮氣流下吹干。各加入5種不同基質(zhì)的物質(zhì)5mL，按不同的5種方法提取后, 吹干,衍生化。（編號為3，4-含糖、膏基質(zhì)液；5，6-茶和淀粉劑基質(zhì)；7，8-補酒基質(zhì)；9，10-蛋白粉基質(zhì)；11，12-蛋白粉基質(zhì)）。用每個物質(zhì)的特征離子為定性離子，用3、4的平均峰面積/1、2的平均峰面積，5、6平均峰面積/1、2的平均峰面積,5，6平均峰面積/1、2的平均峰面積,， 7、8平均峰面積/1、2的平均峰面積，9、10平均峰面積/1、2的平均峰面積，11、12平均峰面積/1、2的平均峰面積，結(jié)果見表1. 表1NameADCACDDHEMMEMOPEPTM/z172823713733857242928971Extra170.2 %82.6 %68.6 %69.1 %71.4 %91.6 %73.1 %89.6 %82.7 %Extra273.2 %84.3 %76.1 %76.5 %74.3 %89.6 %80.1 %86.7 %80.4 %Extra370.3 %80.7 %72.9 %73.8 %70.9 %80.6 %76.6 %78.6 %79.8 %Extra480.3 %86.7 %82 %78.9 %76.3 %88.4 %70.8 %72.6 %70.4 % Extra