植物組織MDA含量測(cè)定.doc

植物組織MDA含量測(cè)定一、目的要求1掌握植物組織MDA含量測(cè)定的原理及具體測(cè)量步驟；2深化理解MDA與逆境和衰老的關(guān)系，理解植物組織MDA含量測(cè)定的意義；3了解膜脂過(guò)氧化、氧自由基和MDA形成的關(guān)系；4能夠根據(jù)待測(cè)材料的具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定MDA含量；5學(xué)習(xí)分光光度計(jì)，低溫離心機(jī)等儀器的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物遭受逆境脅迫或衰老時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低，活性氧平衡失調(diào)及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。活性氧代謝失調(diào)直接導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的大量積累，從而引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過(guò)氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過(guò)測(cè)定MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。MDA在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮（Trimetnine），又名三甲川，該物質(zhì)在532nm處有最大光吸收，在600nm處有最小光吸收。由于TBA也可與其它物質(zhì)反應(yīng)，并在532nm處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響，同時(shí)測(cè)定600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸光度的差值計(jì)算MDA的濃度。即：A532A600CL式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值，C是MDA濃度，L為比色杯厚度，=155Lmmol-1cm-1。TBA MDA 3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)可能對(duì)MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用。可用下列公式消除由蔗糖引起的誤差。 C（molL-1）=6.45(A532A600) 0.56A450三、材料與設(shè)備1材料：四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對(duì)照。2儀器：(1) 分光光度計(jì)；(2) 冷凍離心機(jī)；（3）水浴鍋；(4) 天平；(5) 研缽；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度離心管；(9) 刻度試管(10ml)；(10) 鑷子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3藥品(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液；(2) 5三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，然后定容到100ml；(3) 0.5的TBA溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5三氯乙酸溶解，定容至100ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1MDA的提取：取樣品0.5g（W），加入2ml預(yù)冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。4500rpm，4度，離心10min，上清液即為MDA提取液，測(cè)量提取液的體積（V）。2MDA含量測(cè)定：吸2ml（V2）的提取液于刻度試管中（空白為2ml緩沖液），加入3ml 0.5的TBA溶液，將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí)）。到時(shí)間后，立即將試管取出并放入冰浴中。4500rpm，4度，離心10min，取上清液并量其體積（V1）。上清液于532nm、600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。3結(jié)果計(jì)算:MDA(nmolg-1)6.452(A532A600) 式中，V1為反應(yīng)液總量（ml）；V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量(ml)；V為提取液總量（ml）； W為植物樣品重量(g)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告樣品處理重復(fù)A532A600MDA含量（nmolg-1）綠葉高溫處理123平均標(biāo)準(zhǔn)差室溫對(duì)照123平均標(biāo)準(zhǔn)差黃葉高溫處理123平均標(biāo)準(zhǔn)差室溫對(duì)照123平均標(biāo)準(zhǔn)差六、思考題1TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？2提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時(shí)間又不能過(guò)長(zhǎng)？3為什么要測(cè)定反應(yīng)液在600nm下的吸光度？4如果可溶性糖含量影響MDA含量的測(cè)定，你有什么辦法消除其影響？5正常植物與衰老時(shí)相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。七、注意事項(xiàng)1可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），當(dāng)植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高，必要時(shí)要