產(chǎn)纖維素酶真菌的分離、篩選及酶活測定.doc

產(chǎn)纖維素酶真菌的分離 篩選及酶活測定 摘 要 產(chǎn)酶纖維素微生物在纖維素資源的再生轉化 提高牲畜飼料利用率 堆肥的使 用以及環(huán)境污染等方面具有很高的應用價值 而分離高效纖維素降解菌是這一內容 的前提與基礎 本研究利用選擇培養(yǎng)基 CMC 培養(yǎng)基 從學校周圍的土壤中分離得 到 6 株降解纖維素的真菌 它們都具有較強的纖維素降解能力 尤其以編號為紙綠 和江白活性最高 隨后對這 6 種菌株進行酶活測定 從中得到一株高酶活的菌株 其 在 CMC 培養(yǎng)條件下酶活達到 40 U 關鍵詞 纖維素降解菌 篩選 纖維素酶活 鑒定 Separation screening and enzymatic activity of cellulase produced by fungi Abstract Microbial fermentation of cellulose micro organisms especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed compost use and environmental pollution has a high application value And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard In this study selective medium CMC medium Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose They have a strong ability of cellulose degradation particularly in the number of paper green and White River the highest activity And the 6 strains with a high activity were morphological physiological and biochemical identification Key Words Cellulose degrading bacteria Filter Cellulase activity Identification 目 錄 摘 要 I ABSTRACT II 1 前言 1 1 1 纖維素概述 1 1 2 纖維素酶 2 1 3 纖維素分解菌類 4 1 4 本文研究的目的與意義 6 2 實驗部分 6 2 1 材料 6 2 2 主要試劑與儀器 6 2 3 培養(yǎng)基 8 2 4 菌種的分離與篩選 9 2 5 纖維素酶活性測定 10 2 6 形態(tài)特征觀察 12 2 7 生理生化特性鑒定 12 2 8 菌種保藏 13 3 結果與討論 13 3 1 初篩選得到的各菌株的菌落形態(tài)特征描述 13 3 2 復篩獲得的菌株圖片 14 3 3 葡萄糖標準曲線的繪制 16 3 4 各菌的酶活力測定結果 17 4 結論 17 參考文獻 18 致謝 20 邵陽學院畢業(yè)論文 1 1 前 言 纖維素是自然界中存量最大的一類可再生資源 全世界每年產(chǎn)農作物秸稈約 1000 2000 億噸 我國是一個農業(yè)大國 又是一個畜牧業(yè)大國 據(jù)粗略統(tǒng)計 我國每 年產(chǎn)生農作物秸稈約 7 億噸 含大量未降解纖維素組分的禽畜糞肥 17 3 億噸 然而 由于纖維素中存在許多高能氫鍵 因此其水解 利用較困難 目前只利用了其中很 小的一部分 大部分的纖維素類物質都被棄置 既浪費資源又會對環(huán)境造成極大的 污染 因此合理開發(fā)和科學利用這一豐厚的天然資源已成為研究開發(fā)的一個重點領 域 1 微生物在自然界纖維素的降解中有著舉足輕重的作用 我國纖維素酶的研究已 有幾十年的歷史 并且已篩選出一批纖維素酶產(chǎn)生菌種 目前 用于生產(chǎn)纖維素酶 的微生物大多屬于真菌 如木霉屬 Trichoderma 曲霉屬 Aspergillus 和青霉屬 Penicillium 2 然而 用于纖維素酶生產(chǎn)的菌株普遍存在酶活力較低的問題 3 因 此 篩選優(yōu)良菌種是提高纖維素酶活力 從而提高纖維素降解效率的關鍵 1 1 纖維素概述 纖維素是植物體中最重要的組成成分之一 是細胞壁的主要組成成分 約占植 物干重的40 以上 據(jù)粗略估計 全世界纖維素的資源約為70億噸 而每年經(jīng)綠色 植物光合作用合成的纖維素產(chǎn)量高達40億噸 因此 毫無疑問 纖維素是公認的地 球上數(shù)量最豐富的可再生有機物質資源 從結構上看 纖維素是由許多個葡萄糖分 子通過 1 4 糖苷鍵連接而成的直鏈聚合物多糖 纖維素與淀粉在分子結構上的差別 僅在于葡萄糖基連接時的構型不同 淀粉是通過 1 4 糖苷鍵連接的 而這一不同點 使兩者水解的難易程度相差懸殊 纖維素的聚合度范圍非常寬 分子中單糖結構片 斷可以從幾百到一萬五千左右 是一種高分子化合物 自然界存在的纖維素 分子鏈之間還存在著氫鍵的締合作用 這使纖維素分子 之間形成纖維素束 天然的纖維素由排列整齊而規(guī)則的結晶區(qū)和相對不規(guī)則 松散 的無定型區(qū)組成 4 邵陽學院畢業(yè)論文 2 1 2 纖維素酶 1 2 1 纖維素酶的組成 纖維素的生物降解現(xiàn)象早在1886年就被發(fā)現(xiàn) 1912年Pringsheim首次將 纖維素 酶 cellulase 的概念引入文獻中 但直到1950年之后才有纖維素酶相關的系統(tǒng)性文 章報道 由于纖維素物質具有復雜的結構 任何單一的酶都難以高效地水解它 因 此降解纖維素的微生物往往要產(chǎn)生多種纖維素酶類 還要伴隨著各種半纖維素酶的 產(chǎn)生 組成一個復雜的酶系統(tǒng)以降解植物細胞壁物質 同時 又由于降解纖維素的 微生物種類不同 所產(chǎn)生的纖維素酶組分也不盡相同 構成了各具特色的纖維素降 解酶體系 所以 纖維素酶不是一個單種酶 而是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶 的總稱 主要有C酶和G酶 是起協(xié)同作用的多組分酶系 由于微生物的不同 其產(chǎn)生的纖維素酶組分也是不相同的 構成了各具特色的 纖維素降解酶系 其內切酶 外切酶的含量 種類比例和活性的大小都有很大的 在同一菌株的纖維素酶系中 每一類纖維素酶往往存在多個結構 功能和活性不同 的組分 每一組分又可能由不同的亞組分組成 按照纖維素降解微生物的能力和纖 維素酶系之間的關系 可將纖維素酶系分為三類 一是對天然纖維素的降解能力比 較弱 但可大量合成分泌到胞外的纖維素降解酶系 這種酶的組分是游離的 如常 見的木霉 青霉的纖維素酶系 二是對天然纖維素降解能力強 但分泌到胞外的纖 維素酶活力較低的酶系 如擔子菌類等 三是對天然纖維素分解能力強 但基本無 纖維素酶分泌到胞外的酶系 如厭氧細菌的纖維素酶系 此外 能夠降解無定形纖維素和結晶纖維素的酶系稱為 complete cellulase system 或全值酶系 full cellulase system 而僅能水解無定形纖維素的纖維素酶系稱 為不完全酶系 uncompleted cellulase system 或低值酶系 10w value cellulase system 纖維素酶是多組分酶體系 是具有纖維素降解能力酶的總稱 1950年Reese提出C G 酶的概念 隨著研究的深入 每種酶的組分和作用機理已被逐漸闡明 根據(jù)它們作 用于纖維素和降解的中間產(chǎn)物可以分為三類 外切葡聚糖酶包括兩類酶 一類是 1 4 D 葡聚糖 葡萄糖水解酶 也稱為纖維素糊精酶 Ec3 2 1 74 第二類酶為纖維二 糖水解酶 cellobiohydrolases CBH 即 1 4 D 葡聚糖 纖維二糖水解酶 exo 1 4 D glucanases EC3 2 1 91 簡稱外切酶 CBti是纖維素酶系中的重要組分 在天然纖維 邵陽學院畢業(yè)論文 3 素的降解過程中起主導作用 可以水解微晶纖維素和棉花等結晶度高的纖維素 作 用于無定形纖維素的非還原末端或還原端 水解 1 4 D 糖苷鍵 依次切下一個纖維 二糖分子 生成可溶的纖維糊精和纖維二糖 內切纖維素酶 endoglueanases EG 或 內切葡聚糖酶 即內切 1 4 D 葡聚糖q 葡聚糖水解酶 endo 8 glucanasea EC3 2 1 4 簡稱內切酶 也稱cx酶 CMC酶 內切纖維素酶隨即地水解磷酸膨脹纖維素 羧甲 基纖維素等無定形纖維素的非定形區(qū) 無規(guī)則水解 1 4 D 糖苷鍵 形成葡萄糖 纖 維二糖纖維三糖和不同大小的纖維糊精 為纖維二糖水解酶提供更多的可供水解的 末端 1 4 D 葡萄糖苷酶 6 glucosidases B 6或BG 或B D 葡萄糖苷 葡萄糖水解酶 EC3 2 1 21 又稱纖維二糖酶 cellobiase CB 它主要裂解纖維二糖和從小的纖維 素糊精的非還原末端水解葡萄糖殘基 生成葡萄糖產(chǎn)物 它的水解速率隨底物大小 的降低而增加 以底物為纖維二糖時水解速率最快 嚴格地講 葡萄糖苷酶不能算 作纖維素酶 但它可以減輕纖維二糖對纖維素酶的反饋抑制作用 酶解纖維素時 對無定形區(qū)僅EG即可使之水解 對于結晶區(qū)需要有EG和CB的協(xié)同作用 因此 在 纖維素溶解糖化過程中與CBH的比值會顯著地影響纖維素溶解活力 而且在纖維素 糖化過程中CB組分的加入會使這種協(xié)同作用大大加強 但是 CB與EG CB與CBH 的協(xié)同作用都很弱 1 2 2 纖維素酶的種類以及作用機理 微生物分解纖維素依賴于細胞所產(chǎn)生的纖維素酶 纖維素酶不是單種酶 而是 起協(xié)同作用的多種酶系 14 可分為以下三類 第一類是葡聚糖內切酶 或稱CMC酶 或CX酶 這類酶作用于纖維素分子內部的非結晶區(qū) 隨機水解 1 4 糖苷鍵 將長 鏈纖維素分子截短 產(chǎn)生大量帶非還原性末端的小分子纖維素 第二類是葡聚糖外 切酶 或稱微晶纖維素酶 纖維二水解酶或C1酶 這類酶作用于纖維素分子末端 水解 1 4糖苷鍵 每次切下一個纖維二糖分子 第三類是 葡萄糖苷酶 1 4 glucanase EC 3 2 1 2l簡稱BG 或稱纖維素二糖酶 這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖 分子 雖然它對纖維素無作用 但它可以消除上述兩種酶催化反應的終產(chǎn)物對反應 的抑制作用 從而加快反應速度 纖維素酶的降解機理 1950年 Reese等曾闡明沒有一種纖維素酶生產(chǎn)菌能生產(chǎn) 出分解棉花中的天然纖維素的酶 但發(fā)現(xiàn)有的菌株生產(chǎn)的酶能分解膨潤的纖維素或 邵陽學院畢業(yè)論文 4 纖維素誘導體等非晶體性纖維素 因而提出了由于天然纖維素的特異性而必須以不 同的酶協(xié)同作用才能分解的C1 Cx假說 該假說認為 當纖維素酶作用時 首先對 纖維素的Cl組分起作用 繼而使Cx組分變成纖維低聚糖 再由 葡萄糖苷酶分解成 葡萄糖 Wood在研究木霉 Trichodermareesei 青霉 Penicilli umfuniculosumde 的纖 維素酶水解纖維素時 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中的兩種外切酶在液化微晶纖維素和棉纖維時具 有協(xié)同作用 Kanda等還發(fā)現(xiàn)只是對可溶性纖維素進攻方式不同的兩種內切葡萄糖酶 在結晶纖維素的水解過程中也具有協(xié)同作用 協(xié)同作用一般認為是內切葡萄糖酶首 先進攻纖維素的非結晶區(qū) 形成外切纖維素酶需要的新的游離末端 然后外切纖維 素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位 葡萄糖苷酶再對纖維二糖單位進行 水解 形成葡萄糖 目前人們普遍認為纖維素酶是分解以 1 4葡萄糖苷鍵結合的纖 維素物質 首先由Cx組分對纖維素的非晶體部分進行切割 然后由Cl組分以纖維二 糖為單位從末端對其緩緩分解 最終由 葡萄糖苷酶分解為葡萄糖 1 3 纖維素分解菌類 1 3 1 纖維素分解菌類簡介 自然界能產(chǎn)生分解纖維素的酶的微生物很多 包括細菌 放線菌和真菌 5 自 1906年Selliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來 人們相繼在細菌 真菌等微生 物中分離到能降解纖維素的酶 其中 以細菌的生長和降解效果較穩(wěn)定 但對纖維 素作用較強的是木霉屬 Trichoderma 曲霉屬 Aspergillus 青霉屬 Penieillium 和枝 頂孢霉屬 Aeremonium 的菌株 其中真菌木霉屬是迄今所知形成和分泌纖維素酶系 成分最全面 獲利最高的一個屬 國內外許多研究人員對此作了很多報道 經(jīng)形態(tài) 學 生理生化反應 生態(tài)特性和遺傳型的鑒定 WQ 1歸類為瘤胃球菌屬 Rum inococcus 的黃色瘤胃球菌 Rum inococcus flavefaciens WH 2歸類為丁酸弧菌屬 utyrivibrio 的溶纖維丁酸弧菌 Butyrivibriofibrisolvens 2002年 崔宗均等從4種堆肥樣品中分別篩選出纖維素分解能力較強的4組混合 菌 再以酸堿反應互補的原則重新優(yōu)化組合并馴化成組纖維素分解能力非常強而穩(wěn) 定的纖維素分解菌復合系MCl 同年 魏桃員等從造紙廠污泥中分離得到了一株能 以纖維素為唯一碳源生長良好的纖維素降解菌w23 經(jīng)鑒定 為假單胞桿菌 2005 年 Souichiro Kato等構建了由五種細菌 梭菌屬菌株CSKl 梭菌屬菌株FG4 黃原酸 邵陽學院畢業(yè)論文 5 假單胞菌屬菌株M1 3 短芽孢菌屬菌株M1和博爾德氏桿菌屬菌株M1 組成的可降解 纖維素的群落 命名為SF356 該群落經(jīng)20次繼代培養(yǎng)它們仍能穩(wěn)定共存 并且降解 纖維素的能力增強了 2006年 吳敏峰等采集健康奶牛的新鮮糞便 利用剛果紅平板染色法分離篩選 具有產(chǎn)纖維素酶活性的芽孢桿菌 并進行細菌菌落 形態(tài)和生化鑒定 結果從牛糞 中分離出35株兼性厭氧的芽孢桿菌 利用剛果紅鑒別培養(yǎng)基篩選出具有分解纖維素 能力的菌株 并測定其水解圈大小 初步篩選出10株纖維素酶高產(chǎn)菌株 并對其進 行了種屬鑒定 一株為梭狀芽孢桿菌 其余9株為芽孢桿菌屬細菌 2006年 伍時華等通過羧甲基纖維素瓊脂平板 濾紙條培養(yǎng)基從自然環(huán)境中篩 選到4株高效纖維素降解菌 其中木霉2株 青霉2株 分別記為T 1 T 2 P 1和P 2 2006年 朱軍莉等從袋裝降解的筍干中分離到一株分解纖維素的細菌菌株 該菌 株呈長桿狀 革蘭氏染色為陽性 產(chǎn)芽孢 命名為BSX5 經(jīng)鑒定 確定該菌株為枯 草芽孢桿菌 2007年 劉玉承等從日糧精粗比為3 7的小尾寒羊 蒙古羊雜交一代綿羊的瘤胃 內容物中分離到2株嚴格厭氧細菌 一株球菌WQ 1 l株弧菌WH 2 二者對濾紙有很 好的降解能力 通過酶活力試驗測得WQ 1的濾紙酶活 羧甲基纖維素酶活和p2葡萄 糖苷酶活分別為0 66 U mL 7 0 U mL和15 3 U mL WH 2的濾紙酶活 羧甲基纖維 素酶活和D 葡萄糖酶活分別為0 52U mL 6 9 U ml和17 2 U mL 同年 韓紹印等從造紙廠廢紙漿中分離到一株纖維素降解細菌CP4 在溫度為 20 50 和pH為5 10的條件下 CP4能夠快速生長并分泌纖維素酶 在35 和pH為 9的條件下 培養(yǎng)8 h后CP4開始產(chǎn)酶 培養(yǎng)3 d后相對酶活為5 43 mm d 經(jīng)初步鑒定 確定該菌株為巨大芽孢桿菌 Bacillus magaterium 1 3 2 纖維素分解菌的選育 近年來 在纖維素分解菌研究領域 還有人通過對已發(fā)現(xiàn)纖維素分解菌進行誘 變 來增加產(chǎn)酶微生物菌種資源 提高纖維素酶的產(chǎn)量 并取得了較大的進步 9 木霉菌經(jīng)化學 物理誘變后 其變異株產(chǎn)纖維素酶性能明顯提高 Hideo等 10 將0 10 秋 水仙素處理35 d的里氏木霉 Trichoderma reese RUTC230 用滅菌靈單倍體化 從單 倍體克隆長成的分生孢子器中分離出高產(chǎn)纖維素酶菌株 隨后分別用含有1 廢紙粉 邵陽學院畢業(yè)論文 6 的培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基和含有1 的微晶纖維素的培養(yǎng)基作為二級選擇培養(yǎng)基進行 篩選 篩選出的WP 1菌株對羧甲基纖維素鈉 CMC 微晶纖維素和水楊苷活力分別 是原始菌株的1 9 2 0和3 5倍 韓峰等 11 以擬康氏木霉 Trichoderma pseudokoningii TH為出發(fā)菌株 采用紫外誘變獲得一株抗高濃度葡萄糖阻遏突變株UVIII 纖維素 酶產(chǎn)量顯著提高 Prabavathy等 12 將里氏木霉制備成原生質體并融合 在CMC瓊脂 平板上再生 篩選了15個融合體 相對于原始菌株 在CMC平板上出現(xiàn)的透明圈更 加明顯 其中 有2株融合子SFTr2和SFTr3相對于原始菌株PTr2酶活提高了2倍多 13 纖維分解細菌經(jīng)離子束注入誘變 其突變菌株產(chǎn)纖維素酶活性也明顯提高 曾憲賢 2005 等對纖維分解細菌HY2進行不同劑量離子束注入誘變 篩選出纖維素酶活性高 的突變菌株HY2 3 通過聚合酶鏈式反應PCR技術擴增得到纖維素酶高產(chǎn)菌株芽孢桿 菌 Bacillus sp HY2 3以及原始菌株芽孢桿菌HY2的纖維酶基因chy2 3和chy2 經(jīng)過克 隆和序列分析表明 所得到的突變型和野生型纖維素酶基因編碼區(qū)均為1500 bp 同 時發(fā)現(xiàn) 經(jīng)過離子束誘變得到的高產(chǎn)菌株和野生菌株的纖維素酶基因序列存在差別 這些堿基突變引起氨基酸序列的改變有可能導致兩個菌株纖維素酶產(chǎn)量上的不同 1 4 本文研究的目的與意義 本文主要從邵陽學院周圍的土壤篩選出能夠高效降解纖維素的菌株 并從形態(tài) 學和生理生化等方面對篩得的菌株進行菌種鑒定 高效纖維素降解菌在環(huán)境污染 堆肥 動物飼料等方面起到不可替代的作用 2 實驗部分 2 1 材料 微生物分離樣品來自邵陽學院周邊的土壤 2 2 主要試劑與儀器 2 2 1 主要藥品及試劑 本實驗所用的主要試劑見表2 1 表 2 1 試劑 Table2 1 regents 藥品名稱分子式純度或含量生產(chǎn)廠家 邵陽學院畢業(yè)論文 7 磷酸氫二鉀K2HPO4 3H2OAR天津市東麗區(qū)泰蘭德化學試劑廠 磷酸二氫鉀KH2P04AR天津市東麗區(qū)泰蘭德化學試劑廠 硝酸鈉NaNO3AR天津市科密歐化學試劑有限公司 硫酸鎂MgSO4AR上海試一化學試劑有限公司 氯化鈣CaCl2AR天津市天達凈化材料精密化工廠 氯化鈉NaClAR天津市凱通化學試劑有限公司 氯化鉀KCl H2OAR天津市科密歐化學試劑有限公司 硫酸亞鐵FeSO4 7H2OAR天津市恒興化學試劑制造有限公司 硫酸鋅ZnSO4 7H2OAR天津市化學試劑三廠 硫酸錳MnSO4 H2OAR上海實驗試劑有限公司 羧甲基纖維素鈉C6H11NaO7AR上海山浦化工有限公司 檸檬酸鈉C6H5Na3O7 2H2OAR天津市天力化學試劑有限公司 剛果紅C32H22N6Na2O6S2AR湖南湘大化工試劑有限公司 檸檬酸C6H8O7 H2OAR上海國藥集團化學試劑有限公司 3 5 二硝基水楊酸C6H8O7 H2OAR國藥集團化學試劑有限公司 瓊脂AR武漢鼎國生物技術有限公司 注 1 AR Analytical reagent 分析純試劑 2 主要分子生物學試劑見具體實驗方法部分 1 DNS試劑 稱取5 g 3 5 二硝基水楊酸溶于蒸餾水中 加入10 g氫氧化鈉 100 g酒石酸鉀鈉和250 mL水 加熱溶解后再加入結晶酚1 g 無水亞硫酸鈉0 5 g 待全部溶解后冷卻 定容至500 mL 貯于棕色瓶中 放置一周后使用 使用前過濾 2 l 剛果紅試劑 稱取剛果紅試劑l g于干凈的小燒杯中 用量筒量取蒸餾水 100 mL使之溶解 過濾 貯于棕色試劑瓶中 3 0 2 M Na2HPO4溶液 取17 907 g Na2HPO4 12H2O加水溶解 定容至250 mL 4 0 1 M檸檬酸 取5 2535 g檸檬酸加水溶解 定容至250 mL pH 7 0 5 pH 4 4 Na2HPO4 檸檬酸緩沖液 量取205 875 mL 0 2M Na2HPO4和44 125 mL 0 1 M檸檬酸于250 mL燒杯中 調pH值 貯于試劑瓶中備用 6 1 CMC溶液 取l g CMC粉末緩慢的加到l00 mL pH4 4的Na2HPO4 檸檬酸緩 沖液中 邊加邊攪拌 并用熱水浴使其充分溶解 轉于試劑瓶并放冰箱保存 2 2 2 實驗儀器 高壓蒸汽滅菌鍋 細菌培養(yǎng)箱 離心機 分光光度計 震蕩培養(yǎng)箱 水浴鍋 普通光學顯微鏡 數(shù)字顯微圖像處理系統(tǒng) 激光共聚焦顯微鏡 PCR儀 電泳儀 冰箱 超凈工作臺 電熱爐 紫外誘變箱 微波爐 PH計 電子天平等 邵陽學院畢業(yè)論文 8 2 3 培養(yǎng)基 1 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基I CMC Na 20 g NaCl 5 0 g MgSO4 7H2O 0 2 g KH2PO4 1 0 g 酵母浸出物5 0 g 蛋白胨10 g 水1000 mL 瓊脂20 g pH自然 121 滅菌20 min 2 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基II CMC 20 g Na2HPO4 2 5 g KH2PO4 0 5 g 白胨 2 5 g 酵母膏0 5 g 水1000 mL 瓊脂20 g pH自然 121 滅菌20 min 3 發(fā)酵培養(yǎng)基 CMC 20 g Na2HPO4 2 5 g KH2PO4 1 5 g 蛋白胨2 5 g 酵母 膏0 5 g 水1000 mL pH自然 121 滅菌20 min 4 濾紙條培養(yǎng)基 試管中加入上述無機鹽溶液5 mL 加1條瓦特曼濾紙 6cm 1cm 垂直立于試管中 并使一部分露出液面 加棉塞121 30 min滅菌 5 剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基 KH2PO4 0 5 g MgSO4 7H2O 0 25 g 瓊脂15 g 明膠2 0 g CMC1 88 g 剛果紅0 20 g 蒸餾水1000 mL pH值自然 6 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g 葡萄糖20 g 瓊脂20 g 水1000 mL 自然PH 制法 馬鈴薯去皮后 切成小塊 加水煮爛 煮沸20 30 min 能被玻璃棒戳破即可 用4層紗布過濾 再加糖和瓊脂 加熱融化后飛 再補足水分至1000 mL 121 下滅菌20 min 7 察氏培養(yǎng)基 硝酸鈉3 g 磷酸氫二鉀1 g 硫酸鎂 MgSO4 7H2O 0 5 g 氯 化鉀0 5 g 硫酸亞鐵0 01 g 蔗糖30 g 瓊脂20 g 蒸餾水1000 mL 8 改良馬丁培養(yǎng)基 蛋白胨5 0 g 磷酸氫二鉀1 0 g 酵母浸出粉2 0 g 硫酸 鎂0 5 g 葡萄糖20 0 g 水1000 mL 9 基礎培養(yǎng)基 NH4 2SO4 2 g MgSO4 7H2O 0 2 g NaH2PO4 H2O 0 5 g CaCl2 2H2O 0 1 g K2HPO4 0 5 g 蒸餾水1000 mL pH 6 5 10 淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基 可溶性淀粉 20 0 g MgSO4 7H2O 0 1 g K2HPO4 0 5 g NaCl 0 5 g KNO3 1 0 g 瓊脂 20 g 蒸餾水1000 mL pH 7 2 7 4 121 滅 菌20 min 11 纖維素水解培養(yǎng)基 MgSO4 0 5 g K2HPO4 0 5 g NaCl 0 5 g KNO3 1 0 g 蒸餾水1000 mL pH 7 2 濾紙條 6 cm 1 cm 分裝于試管中 將濾紙條加入試 管中 一半浸在液內 一半露在液面外 121 滅菌20 min 邵陽學院畢業(yè)論文 9 12 保藏用真菌PDA培養(yǎng)基 g L 200 g馬鈴薯加水1000 mL煮費后 再小火煮 30 rnin 8層紗布過濾 加蔗糖20 g 補水1000 mL pH 6 5 2 4 菌種的分離與篩選 2 4 1 分離與初篩菌株的方法 1 配CMC培養(yǎng)基 滅菌 倒平板 2 制備土壤稀釋液 稱取土樣10 g 放入盛90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角 燒瓶中 振搖約20分鐘 使土樣與水充分混合 將菌分散 3 劃線 用接種針蘸取適量稀釋液在平板上劃線 每個平板劃3到5條線 4 培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置于28 溫室中培養(yǎng)3日 5 挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到羧甲基培養(yǎng)基的平面上 置28 29 溫室中培養(yǎng) 待菌苔長出后 觀察水解圈情況 將菌落用l mg L果紅染 色5 min 將顏色變紅的菌落繼續(xù)劃線分離 檢查菌苔是否單純也可用顯微鏡涂片染 色檢查是否是單一的微生物 若有其他雜菌混雜 就要再一次進行分離 純化 直 到獲得純培養(yǎng)物 6 觀察將純化得到的纖維素降解菌進行觀察對比并記錄生長情況及菌落形態(tài) 等 2 4 2 菌株的復篩 1 配CMC培養(yǎng)基 滅菌 倒平板 2 劃線 用接種針挑取適量初篩的菌種在平板上劃線 每個平板劃3到5條線 3 再次挑菌 將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到羧甲基培養(yǎng)基的平面上 置28 29 溫室中培養(yǎng) 待菌苔長出后 觀察水解圈情況 將菌落用l mg L果紅染 色5 min 將顏色變紅的菌落繼續(xù)劃線分離 檢查菌苔是否單純也可用顯微鏡涂片染 色檢查是否是單一的微生物 若有其他雜菌混雜 就要再一次進行分離 純化 直 到獲得純培養(yǎng)物 4 觀察將純化得到的纖維素降解菌進行觀察對比并記錄生長情況 邵陽學院畢業(yè)論文 10 2 5 纖維素酶活性測定 2 5 1 繪制葡萄糖標準曲線 原理 3 5 二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物 在一定 范圍內還原糖的量和反應液的強度成比例關系 利用分光光度計測出其在540 nm處 的吸光度 得出還原糖的量 配制方法 將葡萄糖放在80 烘干箱內烘干至恒重 然后精確稱取0 040 g葡萄 糖固體溶解于少量蒸餾水中 然后用蒸餾水定容至20 mL 充分混勻 得濃度為2 mg mL的葡萄糖標準溶液 標準曲線的繪制 用1000 mL移液槍分別量取0 L 200 L 400 L 600 L 800 L 1000 L 1200 L于7個干凈的20 ml刻度試管中 用蒸餾水定容 得 到濃度分別為 0 g mL 20 g mL 40 g mL 60 g mL 80 g mL l00 g mL 120 g mL的葡萄糖溶液 各取4 mL加入到已作好標記的帶有刻度的試管中 再分別加入DNS試劑2 mL 加熱煮沸5 min 取出置冷水中冷卻 定容至6 mL 在分 光光度計上測量吸光值 波長為540 nm 以濃度為0 g mL的葡萄糖反應液體作空白 對照 2 5 2 粗酶液的制備 在250 mL三角瓶中裝50 mL培養(yǎng)基 將各菌株接種 30 旋轉搖床振蕩培養(yǎng) 24 h作種子液 用1000 L移液槍量取500 L轉接于250 mL三角瓶中的50 mL培養(yǎng)基 中 于30 振蕩培養(yǎng)48 h 在4 8000 r min離心20 min除去菌體 取上清液作為4 保存待用 2 5 3 酶活力測定方法 關于纖維素酶活力的測定方法很多 至今也沒有統(tǒng)一定論 而且用不同方法測 定 結果也存在一定差異 Teather等認為 對數(shù)酶濃度同剛果紅染色水解圈存在線 性關系 產(chǎn)酶越多 透明圈越大 產(chǎn)酶越快 透明圈出現(xiàn)越早 然而 雖然透明圈 大小直接反映了酶濃度的高低 但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力 試驗表明 液體樣 品的酶濃度與透明圈的直徑成線性關系 可以對酶活進行初步定量 但不能作為菌 株產(chǎn)酶活力大小的唯一定量指標 因為剛果紅纖維素平板篩選法受菌苔大小 菌苔 邵陽學院畢業(yè)論文 11 在平板上的堆積情況 菌落之間相互位置和產(chǎn)物或分泌物的相互抑制 不同菌株生 長和產(chǎn)酶速度 不同細菌細胞壁的特性等因素的影響 并不能精確反應纖維素酶活 力的大小 15 因此本試驗最初以水解圈的大小來判定纖維素降解能力 進而篩選出 纖維素降解能力較強的菌株 酶活力測定中大都采用DNS法來測定還原糖的生成量 因為該法簡易 靈敏度 較高 但是由于纖維材料水解的是包括葡萄糖 纖維二糖及幾種纖維寡糖的混合物 因此以葡萄糖為標準反映出的還原糖生成量與實際還原糖的生成量有一定的差異 這種差異很小 一般的定糖方法無法解決 只有用高效液相色譜 HPLC 等分析方法 才能實現(xiàn) 16 由于實驗條件和時間的限制 本試驗以葡萄糖為標準測定還原糖含量 不考慮不同還原糖的差異 因此本試驗采用DNS法來測定纖維素酶活力的大小 具 體操作方法如下 以2 mL 1 0 CMC溶液為底物 用pH為4 4 濃度為0 2 mo1 L Na2HP04 0 1 mol L 檸檬酸緩沖液配制 加200 L上清液 再加2800 L蒸餾水 于50 保溫30 min 然 后加人2 mL DNS試劑 沸水浴5 min 然后一起放入涼水至室溫 在540 nm測光密 度值 OD540nm 以相應空白樣 2 mL 1 0 CMC溶液為底物 3 mL滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)液 于47 保溫30 min 然后加入2 mL DNS試劑 沸水浴5 min 然后一起放入涼水至室 溫 2 5 4 酶活力計算方法 葡萄糖濃度計算公式 根據(jù)葡萄糖標準曲線 將吸光度值代入一元線形回歸方 程 即可得到葡萄糖的濃度 x y b k ug mL x代表橫坐標葡萄糖的生成量 葡 萄糖濃度換算公式 見公式 2 1 x2 4x1 3 2 1 y代表縱坐標 b代表截距 k代表斜率 xl代表利用葡萄糖標準曲線獲得的相應 葡萄糖濃度 x2代表酶液作用一定量底物后生成的葡萄糖的濃度 根據(jù)酶活力定義得 酶活力計算公式 2 2 U x t u 2 2 U代表酶活 t代表酶作用時間 u代表稀釋度 酶活力單位定義為 在測定條件下 分解l CMC溶液每分鐘產(chǎn)生l g葡萄糖定 邵陽學院畢業(yè)論文 12 義為1個纖維素酶活力單位 篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株作進一步的鑒定和產(chǎn)酶條件的研究 2 6 形態(tài)特征觀察 2 6 1 菌落形態(tài)觀察 純化了的菌株分別劃線和點種于平板上 30 培養(yǎng) 觀察菌落形態(tài) 顯微鏡水浸片觀察法 取干凈載玻片 加無菌水一滴 用接種環(huán)挑取少量菌體 放入無菌水中 蓋好蓋玻片 鏡檢 2 6 2 培養(yǎng)特征觀察 將菌株分別接種在CMC培養(yǎng)基平板上 于30 培養(yǎng) 分別于7 d 15 d和30 d肉 眼觀察其培養(yǎng)特征及顏色變化 取成熟期的顏色作為定種的依據(jù) 觀察和記錄如下 項目 氣生菌絲體顏色 指孢子絲未形成前的顏色 孢子絲和孢子的顏色 即成熟孢子堆的顏色 基質菌絲體的顏色 即菌落背面的顏色 另外 還要觀察記錄菌株在以上各種培養(yǎng)基上生長的情況 菌落的外觀形態(tài)如 粉狀 絨狀和棉絮狀等作為參考特征 17 2 7 生理生化特性鑒定 2 7 1 淀粉水解 許多細菌產(chǎn)生淀粉酶 能水解培養(yǎng)基中的淀粉為無色糊精等小分子物質 或進 一步水解為麥芽糖或葡萄糖 淀粉水解后 遇碘不變藍色 具體方法如下 1 將剛滅菌的已溶化的淀粉培養(yǎng)基冷卻至50 左右 無菌操作制成6個平板 2 將待鑒定的菌株在不同的板上劃線接種 每種菌接兩個平板 剩余兩個作 為空白對照 3 將接種了待鑒定菌株的平板和空白對照平板倒置在30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 觀察各種細菌的生長情況 培養(yǎng)3 4 d 多數(shù)菌株已生長成熟 將平板打開 蓋子 滴入少量LUGOL S碘液于平皿中 輕輕旋轉平板 使碘液均勻鋪滿整個平板 邵陽學院畢業(yè)論文 13 5 如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈 說明淀粉已被水解 為陽性 透明圈的大小可 初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱 即產(chǎn)生胞外淀粉酶活力的高低 2 7 2 纖維素水解試驗 1 將剛滅菌的纖維素水解培養(yǎng)基放置于無菌操作臺冷卻 2 將待鑒定的菌株接種在液面外一段濾紙條上 另留兩管作為空白對照 3 將接種了待鑒定菌株的試管和空白對照試管放置于試管架中 置于30 的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 第5 d觀察結果 如菌種能在濾紙條上生長 并分解紙條成一團松散纖維 或使之折斷 碎裂成粉質狀 表示該菌株產(chǎn)生纖維素酶 若紙條不被分解 則該菌 株不產(chǎn)生纖維素酶 2 8 菌種保藏 紙綠 江白 江長毛 江短毛 江土利用PDA培養(yǎng)基保藏于 80 冰箱中 瘤黑 利用改良的馬丁培養(yǎng)基保藏與 80 冰箱中 3 結果與討論 3 1 初篩選得到的各菌株的菌落形態(tài)特征描述 初篩后得到的各菌株的菌落形態(tài)特征如表3 1 表 3 1 初篩后各菌株的菌落形態(tài) Tab3 1 Colony morphology of the various strains after the initial screening 菌株名稱菌落顏色菌落邊緣表面特征水解圈描述 紙綠先期黃色 后期綠色不整齊 齒狀表面光滑明顯 江白白色不整齊 齒狀表面光滑明顯 江長毛乳白色 背面黃色不整齊 齒狀表面光滑明顯 江短毛乳白色 背面紅色不整齊 齒狀表面光滑明顯 瘤黑黑色不整齊 齒狀表面光滑明顯 江土 正面帶黃色的白色 背面顯紅色 不整齊 齒狀表面光滑明顯 邵陽學院畢業(yè)論文 14 3 2 復篩獲得的菌株圖片 1 紙綠 在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 培養(yǎng) 菌落初為白色絮狀 繼而轉為淺 綠色 后變?yōu)樯罹G色 菌落背面無色略灰色 如圖3 1 圖3 1 紙綠在PDA培養(yǎng)基上生長情況 Fig 3 1 The growth of Zhilv on the PDA medium 2 江土 在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 培養(yǎng) 菌落為帶黃色的白色 背面顯血紅 色 如圖3 2 3 3所示 圖3 2 江土在PDA培養(yǎng)基上 正面 生長情況 Fig 3 2 The growth of Jiangtu on the PDA medium positive 圖3 3 江土在PDA培養(yǎng)基上 反面 生長情 況 Fig 3 3 The growth of Jiangtu on the PDA medium negative 3 瘤黑 在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 培養(yǎng) 菌落顯黑色 孢子黑色 后期孢子 很多 很干燥 生長旺盛 菌叢黑褐色 頂囊大球形 小梗雙層 分生孢子為球形 呈黑色 粗糙且干燥 菌絲發(fā)達多分枝 上分生孢子頭狀如 菊花 如圖3 4所示 邵陽學院畢業(yè)論文 15 圖3 4 瘤黑在PDA培養(yǎng)基上生長情況 Fig 3 3 The growth of Liuhei on the PDA medium 4 江長毛 在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 培養(yǎng) 乳白色 棉絮狀 在CMC培養(yǎng)基 上毛長的非常長 覆蓋整個培養(yǎng)皿 菌絲很明顯 背面黃色 在PDA上生長一般 如圖3 5 3 6所示 圖3 10 長毛在PDA培養(yǎng)基上 反面 生長情況 圖3 5 長毛在PDA培養(yǎng)基上 正面 生長情況 Fig 3 5 The growth of Changmao on the PDA medium positive 圖3 6 長毛在PDA培養(yǎng)基上 反面 生長情況 Fig 3 5 The growth of Changmao on the PDA medium negative 5 江短毛 在PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 培養(yǎng) 菌落顯白色 菌絲較短 光滑 背面顯紅色 如圖3 7 3 8所示 邵陽學院畢業(yè)論文 16 圖3 7 短毛霉在PDA培養(yǎng)基上 反面 生長情況 Fig 3 7 The growth of Duanmaomei on the PDA medium negative 圖3 8 短毛霉在PDA培養(yǎng)基上 正面 生長情況 Fig 3 8 The growth of Duanmaomei on the PDA medium positive 3 3 葡萄糖標準曲線的繪制 通過配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液 利用DNS法分別對它們在540nm下進行 了吸光度測量 繪制的標準曲線見圖3 9 圖3 9 葡萄糖標準曲線 Fig 3 9 The standard curve of glucose 其中葡萄糖量由公式y(tǒng) 5 43x 0 0906推出x y 5 43 x即為葡萄糖量 單位mg mL 邵陽學院畢業(yè)論文 17 3 4 各菌的酶活力測定結果 各種菌株的CMC酶活測定結果如表3 2 表3 2 菌株的CMC酶活 CMC培養(yǎng)基 測定結果 Tab 3 2 Strains of CMC activity CMC medium determination results 菌株紙綠江白江土江長毛江短毛瘤黑 吸光度4 0873 132 810 7021 620 420 酶活 U 5038 4334 58 6219 895 16 吸光度5 473 392 510 7122 020 381 酶活 U 67 1542 6230 88 7424 84 68 各菌的酶活性和各個菌株的產(chǎn)酶能力有一定的差異 說明各個菌株間的產(chǎn)酶能 力有顯著性