展開劑與顯色.doc

展開劑與顯色選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑是首要任務(wù).一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷己烷苯乙醚THF乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇使用單一溶劑，往往不能達(dá)到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區(qū)分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethylacetate,petroleumether/Acetone,Petroleumether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH,CHCl3/ethylacetate展開劑的比例要靠嘗試.一般根據(jù)文獻(xiàn)中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。展開劑的選擇條件：對的所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開；待測組分的Rf在0.20.8之間，定量測定在0.30.5之間；不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；沸點(diǎn)適中，黏度較小；展開后組分斑點(diǎn)圓且集中；混合溶劑最好用新鮮配制。一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據(jù)需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；強(qiáng)極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調(diào)節(jié)，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達(dá)到最佳效果。我們在實(shí)驗(yàn)中，為了實(shí)現(xiàn)一個配體與其他雜質(zhì)有效分離，曾經(jīng)嘗試了很多種的溶劑組合，最后才找到石油醚EtOAcHCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶劑。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調(diào)整比例（或者加入第三種溶劑）,達(dá)到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點(diǎn)較“拖”），最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開劑里往往加一點(diǎn)點(diǎn)三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質(zhì)來中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質(zhì)，還必須考慮容易從產(chǎn)品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質(zhì)量很有關(guān)系：不同廠家生產(chǎn)的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細(xì)程度，酸性強(qiáng)弱不同，從而導(dǎo)致產(chǎn)品在某個廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質(zhì)含量對分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)有時同一展開條件，上下午的Rf截然不同展開劑的選擇主要根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮在進(jìn)行薄層層析時，首先應(yīng)該知道未知化學(xué)成分的類型，其極性的大致歸屬，從提取液或從色譜柱的流動相極性可知，另外某樣品里含多種化學(xué)成分先按極性不同大致分，然后細(xì)分，對于分離未知的化學(xué)物質(zhì)，展開劑的選擇也是一個摸索的過程，不應(yīng)該僅僅從展開劑考慮，多因素綜合衡量！溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關(guān)系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xí)慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時，當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。 在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數(shù)（）來表示。介電常數(shù)高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強(qiáng)。3被分離物質(zhì)的性質(zhì)：被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強(qiáng)。 當(dāng)然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團(tuán)的數(shù)目愈多，被吸附的住能就會更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會強(qiáng)些。總之，只要兩個成分在結(jié)構(gòu)上存在差別，就有可能分離，關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，吸附劑的吸附強(qiáng)度，與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團(tuán)，則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增，或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系?，F(xiàn)以實(shí)例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當(dāng)以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。 又如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低，亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達(dá)到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。（二）簿層層析：薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進(jìn)行層析時一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。1薄層層析的特點(diǎn)：薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。2吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細(xì)，一般應(yīng)小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過高，以級為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細(xì)而定，薄層粒度越細(xì)，展開距離相應(yīng)縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴(kuò)散影響分離效果。3展開劑的選擇：薄層層析，當(dāng)吸附劑活度為一定值時（如或級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性。但在實(shí)際工作中，顯色劑：碘：適用于不飽和或者芳香族化合物配制方法：在100ml 廣口瓶中，放入一張濾紙，少許碘粒。或者在瓶中，加入10g 碘粒，30g 硅膠高錳酸鉀適用于含還原性基團(tuán)化合物，比如羥基，氨基，醛配制方法：1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH +200mL 水. 使用期3 個月磷鉬酸(PMA)廣譜配制方法：10 g of 磷鉬酸+100 mL 乙醇紫外燈適用于含共軛基團(tuán)的化合物，芳香化合物硫酸鈰：生物堿配制方法：10%硫酸鈰(IV)+15%硫酸的水溶液氯化鐵苯酚類化合物配制方法：1% FeCl3 + 50% 乙醇水溶液.桑色素(羥基黃酮)廣譜, 有熒光活性配制方法：0.1% 桑色素+甲醇茚三酮適用于氨基酸配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸二硝基苯肼(DNP)適用于醛和酮配制方法：12g 二硝基苯肼+ 60mL 濃硫酸+ 80mL 水+ 200mL乙醇香草醛(香蘭素)廣譜配制方法：15g 香草醛+ 250mL 乙醇+2.5mL 濃硫酸溴甲酚綠適用于羧酸，pKa=5.0配制方法：在100ml 乙醇中，加入0.04g 溴甲酚綠，緩慢滴加0.1M的NaOH 水溶液，剛好出現(xiàn)藍(lán)色即至。鉬酸鈰廣譜配制方法：235 mL 水+ 12 g 鉬酸氨+ 0.5 g 鉬酸鈰氨+ 15 mL濃硫酸茴香醛(對甲氧基苯甲