TOLL樣受體4拮抗劑干預周圍神經損傷后的瓦勒變性.doc

www.CRTER.org熊樂，等. TOLL樣受體4拮抗劑干預周圍神經損傷后的瓦勒變性TOLL樣受體4拮抗劑干預周圍神經損傷后的瓦勒變性熊 樂1，張 蓓1，沈若武2，季愛玉3，孫廣強1，邊洪琳3，張鳳玉1，王 毅1，黃 恒4，李華僑1，周善宇5，沈兆康6，王 忠1(青島大學醫(yī)學院，1免疫學教研室，2解剖教研室，山東省青島市 266071；3青島大學附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，山東省青島市 266003；4解放軍第401醫(yī)院手外科，山東省青島市 266072；5青島大學醫(yī)學院整形外科，山東省青島市 266071；6青島市第五十八中學，山東省青島市 266100)引用本文：熊樂，張蓓，沈若武，季愛玉，孫廣強，邊洪琳，張鳳玉，王毅，黃恒，李華僑，周善宇，沈兆康，王忠. TOLL樣受體4拮抗劑干預周圍神經損傷后的瓦勒變性J.中國組織工程研究，2016，20(42):6308-6316.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.012 ORCID: 0000-0003-2714-3637(熊樂)文章快速閱讀：特異性拮抗Toll樣受體4對大鼠坐骨神經損傷早期瓦勒變性及軸突再生的影響熊樂，女，1991年生，湖北省襄陽市人，漢族，青島大學在讀碩士，主要從事神經免疫方面的研究。 通訊作者：張蓓，博士，副教授，青島大學醫(yī)學院免疫學教研室，山東省青島市 266071中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)42-06308-09稿件接受：2016-08-17僅暴露坐骨神經建立坐骨神經離斷模型建立坐骨神經離斷模型 + TAK-242處理假手術組模型組處理組50只Wistar大鼠分別在術后24 h、 3 d、4 d和7 d按各檢測要求進行取材檢測坐骨神經中白細胞介素1 mRNA、單核細胞趨化蛋白1mRNA表達； 檢測坐骨神經中CD68+巨噬細胞和iba1+許旺細胞的表達；觀察坐骨神經髓鞘變化；觀察坐骨神經的病理變化；檢測坐骨神經中生長相關蛋白43蛋白的表達；檢測坐骨神經功能指數(shù)評價大鼠運動功能的恢復情況。結論：Toll樣受體4信號通路參與周圍神經損傷后的瓦勒變性。文題釋義：TOLL樣受體4(TLR4)：人類發(fā)現(xiàn)的第1個TOLL樣受體相關蛋白，由TOLL樣受體4基因編碼的一種蛋白質，參與激活固有免疫。它可以識別許多革蘭陰性細菌的脂多糖(LPS)，也可以選擇性識別革蘭陽性菌，它的配體也包括一些病毒蛋白、多糖及多種內源性蛋白質(如低密度脂蛋白，熱休克蛋白等)。瓦勒變性：即由于各種創(chuàng)傷、牽拉、缺血、高低溫、電擊等原因，直接使神經纖維受損中斷，周圍神經損傷后遠段發(fā)生的軸突壞死、髓鞘分解消失和神經鞘膜增生等一系列蛻變和細胞吞噬過程。摘要背景：外周神經損傷后發(fā)生瓦勒變性，其機制復雜，從免疫學角度對其進行調控可以影響神經早期修復效果。目的：分析特異性拮抗Toll樣受體4(TLR4)對于大鼠坐骨神經損傷早期瓦勒變性及軸突再生的影響。方法：將50只Wistar大鼠隨機分成3組：處理組及模型組橫斷大鼠右側坐骨神經后，行神經外膜端端吻合；假手術組僅游離出坐骨神經，然后關閉切口。術前1 h及術后7 d處理組大鼠每天尾靜脈注射0.15 mg/kg Toll樣受體4拮抗劑TAK-242，模型組及假手術組大鼠尾靜脈注射同等體積生理鹽水。于術后24 h、3 d、4 d和7d取術側坐骨神經。結果與結論：實時定量PCR顯示，與假手術組相比，術后24 h模型組白細胞介素1 mRNA和單核細胞趨化蛋白1 mRNA的表達均明顯升高(P 0.001，P 0.001)，與模型組相比，術后24 h處理組白細胞介素1 mRNA和單核細胞趨化蛋白1 mRNA的表達明顯降低(P 0. 001，P 0. 001)；免疫熒光可見，與模型組相比，術后3 d處理組中CD68+細胞和iba1+細胞表達均顯著下調(P 0. 01，P 0.05)；固蘭染色可見，在術后7 d，模型組和處理組坐骨神經斷端均出現(xiàn)脫髓鞘反應，但與模型組相比，處理組神經斷端髓鞘碎片清除率明顯降低(P 0.05)；蘇木精-伊紅染色可見，在術后7 d，模型組坐骨神經斷端較多炎性細胞浸潤，許旺細胞增殖活躍，神經纖維大量再生通過吻合口，斷端修復正常，處理組神經斷端炎性細胞較少，纖維組織增生較少，吻合口有縫隙，斷端修復能力減弱；免疫組織化學可見，與模型組相比，術后4 d處理組中生長相關蛋白43蛋白表達均顯著下調(P 0.05)；坐骨神經功能指數(shù)顯示，與模型組相比，處理組大鼠在術后20，30和40 d同期比較明顯降低，差異有顯著性意義(P 0.05)。結果證實，Toll樣受體4拮抗劑導致大鼠坐骨周圍神經損傷早期再生延遲，其機6309 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 制可能是抑制了瓦勒變性過程中的的Toll樣受體4信號通路。關鍵詞：組織構建；組織工程；周圍神經；瓦勒變性；TAK-242；Toll樣受體4；巨噬細胞；許旺細胞；神經再生主題詞：周圍神經；Toll樣受體4；髓鞘；組織工程基金資助：山東省高等學?？萍加媱?J14LK10)Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injuryXiong Le1, Zhang Bei1, Shen Ruo-wu2, Ji Ai-yu3, Sun Guang-qiang1, Bian Hong-lin3, Zhang Feng-yu1, Wang Yi1, Huang Heng4, Li Hua-qiao1, Zhou Shan-yu5, Shen Zhao-kang6, Wang Zhong1 (1Department of Immunology, 2Department of Anatomy, 5Department of Plastic Surgery, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 3Department of Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China; 4Department of Hand Surgery, the 401st Hospital of Chinese PLA, Qingdao 266072, Shandong Province, China; 6No. 58 High School of Qingdao, Qingdao 266100, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: The mechanism underlying Wallerian degeneration following peripheral nerve injury is complex. Immune regulation on Wallerian degeneration is beneficial for early repair of perpheral nerve injury.OBJECTIVE: To investigate the effects of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonist on Wallerian degeneration and axonal regeneration after early peripheral nerve injury in rats. METHODS: Fifty male Wistar rats were recruited and randomly divided into treatment group (n=20), model group (n=20) and sham group (n=10). The right sciatic nerves of rats in treatment and model groups were cut and sutured end-to-end, while the sciatic nerves of rats in sham group were only exposed. In the treatment group rats were intravenously injected with 0.15 mg/kg TAK-242 via tail vein 1 hour preoperatively and 7 days postoperatively, and the rats in the other two groups were given intravenous injection of the same volume of normal saline. The sciatic nerves were removed at 24 hours, 3, 4 and 7 days after surgery. Xiong Le, Studying for masters degree, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, ChinaCorresponding author: Zang Bei, M.D., Associate professor, Department of Immunology, Qingdao University Medical School, Qingdao 266071, Shandong Province, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: Real-time PCR indicated that the mRNA expressions of interleukin-1 and monocyte chemoattractant-1 were significantly increased in the model group compared with the sham group at 24 hours after surgery (both P 0.001), while the expressions were significantly decreased after TAK-242 injection (both P 0.001). Immunofluorescence showed that compared with the model group, down-regulated expression of CD68+ and iba1+ cells appeared in the treatment group at 3 days after surgery (P 0.01, P 0.05). Luxol fast blue staining revealed that demyelination at the sciatic nerve stump appeared in both model and treatment groups at postoperative 7 days, but myelin debris clearance in the treatment group was significantly reduced compared with the model group (P 0.05). Hematoxylin-eosin staining showed that a lot of inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers at the sciatic nerve stump were found in the model group, while there were few inflammatory cells, Schwann cells and regenerated nerve fibers in the treatment group at 7 days after surgery. Immunohistochemistry found that the expression of growth-associated protein-43 in the treatment group was significantly lower than that in the model group at 4 days postoperatively (P 0.05). Besides, compared with the model group, a significantly decreased sciatic functional index was found in the treatment group at 20, 30 and 40 days after surgery (P 0.05). These results show that TLR4 antagonists delay early nerve regeneration in rats after sciatic nerve injury probably by inhibiting the TLR4 signaling pathway. Subject headings: Peripheral Nerves; Toll-Like Receptor 4; Myelin Sheath; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Program of High Educations in Shandong Province, No. J14LK10Cite this article: Xiong L, Zhang B, Shen RW, Ji AY, Sun GQ, Bian HL, Zhang FY, Wang Y, Huang H, Li HQ, Zhou SY, Shen ZK, Wang Z. Toll-like receptor 4 antagonist protects against Wallerian degeneration after peripheral nerve injury. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(42):6308-6316.6313ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction周圍神經損傷修復治療是顯微外科的難題之一。周圍神經損傷后，遠端神經發(fā)生營養(yǎng)障礙而出現(xiàn)軸突壞死，髓鞘崩解和鞘膜增生等一系列變化，這個過程稱為瓦勒變性。瓦勒變性整個過程包括：軸索變性，主要表現(xiàn)為遠端軸索腫脹斷裂，吞噬細胞增生活躍吸收壞死組織；近端軸索近向遠側長出許多旁側和終末側支芽，并向遠端延伸；軸突脫髓鞘崩解，吞噬細胞增生活躍吸收崩解產物；許旺細胞增殖活躍，向近端內遷延形成Bungner帶，接觸引導再生軸突向遠端生長，分泌因子引導再生纖維，募集血源性巨噬細胞很快聚集到神經殘端，吞噬髓鞘碎屑；神經纖維細胞增生排列。巨噬細胞在瓦勒變性與神經再生過程中發(fā)揮吞噬變性組織、為再生神經清除障礙的作用，而許旺細胞的增殖對軸突的再生和髓鞘的形成至關重要，二者對神經再生都起著非常重要作用。近年來，越來越多的研究關注周圍神經損傷后，調節(jié)瓦勒變性和軸突再生的細胞和分子機制，從分子免疫學角度在損傷早期縮短瓦勒變性和神經再生時間，提高神經修速度及修復質量，具有重要現(xiàn)實意義。Toll樣受體(TLRs)作為一種模式識別受體，介導天然免疫應答，除了識別病原相關分子模式外，也可識別損傷相關分子模式，如壞死細胞，熱休克蛋白(HSP60，HSP70)和細胞外基質成分1，有趣的是，在神經損傷部位存在大量壞死細胞，而壞死軸突表達熱休克蛋白60和熱休克蛋白70，并且在損傷組織的炎癥反應部位產生細胞外基質組分2。在中樞神經系統(tǒng)，特別是小膠質細胞能表達多種Toll樣受體3，而對于在外周神經系統(tǒng)，許旺細胞上的Toll樣受體近來更受關注。在神經損傷后，表達于膠質細胞及免疫細胞上的Toll樣受體能最先感受到損傷軸突的損傷刺激。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在原代細胞培養(yǎng)條件下，取自出生后2到7 d新生大鼠坐骨神經的許旺細胞中Toll樣受體4有較高表達，并且已有研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷時，脂多糖(Toll樣受體激動劑)能促進瓦勒變性過程中的髓鞘碎片的清除4，但目前關于外周神經系統(tǒng)中Toll樣受體4作用的研究仍為數(shù)不多。因此，本研究著重關注外周神經損傷后瓦勒變性早期，通過調控Toll樣受體4信號通路影響巨噬細胞和許旺細胞的活化，從而對變性髓鞘碎片清除以及神經再生產生的影響。眾所周知，周圍神經損傷后的瓦勒變性過程中，巨噬細胞(局部和血源)和許旺細胞共同參與髓鞘碎片的清除5-7，已有研究證明神經傷后1-3 d大量的巨噬細胞聚積，許旺細胞則在軸突斷裂后3 d達到增殖高峰，脫髓鞘反應于7 d左右達到峰值。而損傷局部的巨噬細胞和許旺細胞可在損傷早期產生白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1等炎性因子調節(jié)髓鞘碎片清除過程8，這些炎性因子在損傷后1 h即可出現(xiàn)，而在24 h表達量最高7-10。實驗建立Wistar大鼠坐骨神經損傷模型，通過注射TAK-242(Toll樣受體4拮抗劑)抑制大鼠Toll樣受體4信號通路,從損傷早期巨噬細胞和許旺細胞募集，變性崩解髓鞘的清除，軸突再生及損傷后期運動功能恢復幾個方面探討Toll樣受體4信號通路對外周神經損傷后瓦勒變性的免疫調控，為周圍神經損傷修復提供一個新策略。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 隨機對照動物實驗。1.2 時間及地點 實驗于2015年9月至2016年2月在青島大學免疫教研室完成。1.3 材料實驗動物：SPF 級 Wistar 雄性大鼠50只，體質量(20020) g，由青島市實驗動物和動物實驗中心提供，動物質量合格證號：SCXK(魯)20090007。 飼養(yǎng)于飼養(yǎng)箱，每箱5只大鼠，通風良好，環(huán)境安靜，溫度為(222) ，相對濕度為60%，自由飲食與進水，買回大鼠適應環(huán)境 1周后開始實驗。試劑及儀器：TAK-242(美國Cayman Chemical公司)；Rabbit Anti-CD68，Rabbit Anti-iba1(北京博奧森生物技術公司)；Goat Anti-Rabbit IgG，F(xiàn)ITC Conjugated(北京康為世紀生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq熒光定量試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；石蠟切片機，冰凍切片機(德國Leica公司)；光學顯微鏡，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。1.4 實驗方法1.4.1 動物分組 50只Wistar大鼠隨機分為處理組(20只)，模型組(20只)和假手術組(10只)。處理組大鼠分別在術前1 h及術后7 d連續(xù)尾靜脈注射0.15 mg/kg TAK-242，模型組及假手術組大鼠尾靜脈注射同等體積生理鹽水。1.4.2 周圍神經損傷動物模型制備 體積分數(shù)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，用8%硫化鈉脫毛術區(qū)皮膚，消毒后將動物俯臥位固定，無菌條件下顯露右側坐骨神經。處理組及模型組于梨狀肌下緣0.8 cm處用利刀橫行切斷坐骨神經，以神經外膜上走行的血管為標記，用8-0無損傷縫合線行神經外膜端端吻合，吻合口縫合4針(見圖1，箭頭表示吻合口)，逐層關閉切口，分別于建模成功后24 h、3 d、4 d和7 d處死；假手術組僅游離出坐骨神經，然后關閉切口，于24 h處死。各組大鼠于術后24 h取下大鼠右側坐骨神經，迅速放入凍存管中在液氮中保存?zhèn)溆茫粚τ谔幚斫M和模型組，于術后3 d處死后取出坐骨神經，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后，再依次放入20%和30%蔗糖中脫水，待脫水完全后包埋進行冰凍切片；處理組和模型組大鼠分別于術后4 d和7 d，用40 g/L多聚甲醛全身灌注后，取坐骨神經置于40 g/L多聚甲醛中固定待檢。圖1 大鼠坐骨神經橫斷模型Figure 1 Model of sciatic nerve transection in rats圖注：A為完整神經；B為橫斷神經(箭頭所指)。BA1.5 主要觀察指標1.5.1 大體觀察 觀察并記錄大鼠術后的存活情況，步態(tài)，術側肢體遠端有無紅腫和潰瘍，肌肉有無萎縮，切口有無感染及下肢感覺的變化。 1.5.2 實時定量PCR測坐骨神經白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1mRNA的表達 用Trizol法提取各組大鼠坐骨神經總RNA。由TaKaRa公司生產的反轉錄試劑盒進行cDNA合成，按照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(no.RR420A)熒光定量試劑盒說明進行real-time PCR反應。管家基因-actin是用來規(guī)范的總RNA量。引物序列：白細胞介素1上游引物：5-GCC AAC AAG TGG TAT TCT CCA-3下游引物：5-CCG TCT TTC ATC ACA CAG GA-3擴增片段為118 bp； 單核細胞趨化蛋白1上游引物：5-AGG ACT TCA GCA CCT TTG A-3下游引物：5-TTC TCT GTC ATA CTG GTC ACT TC-3 擴增片段為116 bp；-actin上游引物：5-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3下游引物：5-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3 擴增片段為206 bp。反應條件：95 預變性30 s，95 5 s，60 45 s，40個循環(huán)。每份RNA樣本均進行3次重復檢測，取其平均Ct值用于結果分析，采用2-Ct方法對白細胞介素1、單核細胞趨化蛋白1mRNA的表達水平進行相對定量。1.5.3 免疫熒光法測CD68+巨噬細胞和iba1+許旺細胞的表達 取神經組織冰凍切片，用 磷酸鹽緩沖液(PBS)水化20 min；體積分數(shù)10%羊血清40 封閉1 h；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入一抗后，4 孵育過夜；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入二抗 FITC山羊抗兔37 孵育2 h；磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次5 min；熒光封固劑封固，熒光顯微鏡觀察及照片拍攝，其中每一組數(shù)據(jù)均來源于3只大鼠至少4張切片染色結果，每張切片隨機取5個非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析免疫陽性細胞面積占總面積比值。1.5.4 坐骨神經髓鞘固蘭染色 以坐骨神經縫合口為中心切取10 mm長的神經組織，遠端緣用9-0無損傷縫線標記方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后經過乙醇梯度脫水、透明、進一步石蠟包埋等過程制成石蠟切塊，做縱行切片連續(xù)切片，切片厚度為4 m，切片脫蠟后，然后作固蘭(Luxol fast blue，LFB)染色。用固蘭液在60 溫度浸泡12 h；隨后應用體積95%乙醇浸洗5 min；加入0.05%碳酸鋰15 s；再應用體積分數(shù)70%的乙醇洗滌，蒸餾水漂洗，進行脫水后，透明封固，在光鏡下觀察坐骨神經的髓鞘改變，其中每一組數(shù)據(jù)均來源于3只大鼠至少4張切片染色結果，每張切片隨機取5個非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析固蘭染色陽性區(qū)域的積分吸光度平均值。1.5.5 坐骨神經病理學觀察 以坐骨神經縫合口為中心切取10 mm長的神經組織，遠端緣用9-0無損傷縫線標記方向，40 g/L多聚甲醛中固定24 h，然后經過乙醇梯度脫水、透明、進一步石蠟包埋等過程制成石蠟切塊，做縱行連續(xù)切片，切片厚度為4 m，然后作蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察坐骨神經的基本結構及有無細胞增生、炎細胞浸潤等改變。1.5.6 免疫組織化學法測生長相關蛋白43(GAP-43)蛋白的表達 制備蠟塊，4 m切片后進行脫蠟、水化、PBS 沖洗及抗原修復等步驟。用正常的山羊血清和體積分數(shù)3%的雙氧水各封閉20 min后加一抗4 過夜。次日用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入生物素標記的羊抗兔 lgG抗體室溫條件下孵育，20 min以后用磷酸鹽緩沖液洗3遍。用DAB液顯色后鏡下觀察實驗結果，適時終止反應。用蘇木精復染5 min后，進一步進行脫水、透明及封固等步驟，同時用磷酸鹽緩沖液代替一抗做相應的陰性對照。顯微鏡下觀察生長相關蛋白43蛋白的表達，其中每一組數(shù)據(jù)均來源于3只大鼠至少4張切片染色結果，每張切片隨機取5個非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫陽性區(qū)域的積分吸光度平均值。1.5.7 大鼠坐骨神經功能指數(shù)(SFI)測定 制作長約50 cm，寬約8.5 cm，高約8 cm的硬紙暗箱，兩端均留門，箱底墊上白紙，將大鼠雙后足蘸墨水后，在紙箱內從一端到另一端行走，每條紙每側足留下四五個足印，選實驗側及正常側足清晰的足印測量3個變量，精確 到mm，算出每只鼠各變量的平均值。術后10，20，30，40和50 d檢測，測量足印長度(PL)，第1腳趾到第5腳趾的距離(TS)，第2足趾到第4足趾的距離(IT)，E和N分別代表實驗側和正常側。將上述3個變量帶入Bain公式計算出SFI：SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS- NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。正常SFI為0，神經功能完全喪失為-100。1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗中所有數(shù)據(jù)均以s表示，采用方差分析或t 檢驗分析，P 0.05的為差異有顯著性意義。2 結果 Results2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗選用Wistar大鼠50只，分為3組，實驗過程無脫失，全部進入結果分析。2.2 大體觀察 各組大鼠均發(fā)育良好，無死亡，切口甲級愈合。術后20 d內，假手術組術后與術前基本無變化，無行動困難、足趾攣縮及足踝部紅腫的表現(xiàn)，針刺足部反應靈敏；處理組和模型組大鼠術后均出現(xiàn)右下肢功能活動受限，術側腿部肌肉均有萎縮現(xiàn)象，足趾攣縮不能伸展，呈拖曳步態(tài)，并出現(xiàn)不同程度右足踝部皮膚紅腫，足趾潰瘍，針刺反應消失。術后40 d，處理組和模型組大鼠開始出現(xiàn)潰瘍干燥，部分大鼠潰瘍愈合。術后50 d，模型組大鼠潰瘍全部愈合，針刺反應靈敏；處理組仍有2只大鼠足趾未完全愈合，針刺反應遲鈍。2.3 實時定量PCR測坐骨神經組織白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1 mRNA的表達 熔解曲線分析顯示2組基因擴增均呈單峰，退火溫度一致，無非特異性擴增。與假手術組相比，在術后24 h，模型組的白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1 mRNA表達水平均顯著升高(P 0.001)。與模型組相比，處理組的白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1 mRNA表達水平均差異降低(P 0.001)。結果見圖2。2.4 免疫熒光法測坐骨神經組織CD68+巨噬細胞細胞和iba1+許旺細胞的表達 術后3 d神經組織切片免疫特異性巨噬細胞 CD68 抗體和許旺細胞iba1抗體染色可見，模型組神經斷端有大量CD68+巨噬細胞和iba1+許旺細胞浸潤，而與模型組相比，處理組CD68+巨噬細胞和iba1+許旺細胞均明顯減少。通過定量，分析距離損傷中心2 mm內遠端免疫陽性細胞面積所占比值顯示，處理組CD68+巨噬細胞明顯減少(P 0.01)，處理組iba1+許旺細胞也明顯減少(P 0.05)。結果見圖3。2.5 大鼠坐骨神經髓鞘固蘭染色 術后7 d坐骨神經固蘭染色可見，髓鞘呈天藍色，軸突不著色，背景為白色,反映在坐骨神經損傷遠端崩解的髓鞘碎片被巨噬細胞清除的情況。假手術組大鼠坐骨神經髓鞘結構完整，排列規(guī)則，厚度均一，模型組和處理組神經斷端可見髓鞘淡染，均為變性崩解的髓鞘，與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片較多(方框內表示兩組殘余髓鞘差異)，通過定量分析，計算距離損傷中心2 mm內遠端被染色髓鞘的積分吸光度平均值，可見與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片較多，差異有顯著性意義(P 0.05)，反映了處理組的崩解髓鞘碎片清除速率明顯降低模型組。結果見圖4。2.6 大鼠坐骨神經組織蘇木精-伊紅染色 術后7d蘇木精-伊紅染色可見，假手術組大鼠坐骨神經組織結構完整，纖維排列整齊，無炎性細胞浸潤，模型組和處理組軸突完全斷裂，髓鞘崩解，模型組較多炎性細胞浸潤，許旺細胞增殖活躍，纖維組織增生明顯，有神經纖維生長通過吻合口，顯示了正常的神經斷端修復狀態(tài)；處理組可見有炎性細胞浸潤，少量許旺細胞增生，吻合口間仍有縫隙，神經斷端修復較差。結果見圖5。2.7 免疫組織化學法測坐骨神經組織生長相關蛋白43(GAP-43)蛋白的表達 用距離神經斷端4 mm處坐骨神經橫切片的生長相關蛋白43表達水平來衡量軸突再生情況。術后4 d免疫組織化學檢測可見，免疫組織化學圖片背景潔凈，幾乎無非特異性染色。生長相關蛋白43免疫陽性產物，均呈深褐色，主要分布于軸突內，生長相關蛋白43主要定位于細胞漿、細胞膜及細胞外基質。通過定量分析，計算免疫陽性細胞的積分吸光度平均值可見，與模型組相比，處理組中生長相關蛋白43蛋白表達均顯著降低(P 0.05) 。結果見圖6。 2.8 大鼠坐骨神經功能指數(shù)(SFI)測定 模型組和處理組大鼠在術后10，20，30，40和50 d，行足跡實驗分析坐骨神經功能指數(shù)，評價大鼠運動功能的恢復情況。各組大鼠行走時步態(tài)穩(wěn)定，足跡清晰。結果顯示，在坐骨神經損傷后10 d，兩組大鼠的坐骨神經功能指數(shù)均為最低值，之后開始逐步上升。處理組在損傷后20，30和40 d，坐骨神經功能指數(shù)均分別明顯低于模型組(P 0.05)。結果見圖7。模型組 處理組單核細胞趨化蛋白 白細胞介素1坐骨神經功指數(shù)(SFI)基因相對表達水平0-50-100-1504003002001000aaaaabb0 20 40 60假手術組 模型組 處理組損傷后時間圖2 大鼠坐骨神經組織中白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1mRNA的表達Figure 2 mRNA expression levels of interleukin-1 and monocyte chemoattractant-1 in sciatic nerve tissue of rats圖注：與假手術組相比，aP 0.001；與模型組相比，bP 0.001。圖7 大鼠坐骨神經功能指數(shù)(SFI)檢測Figure 7 Sciatic functional indexes of rats圖注：與模型組相比，aP 0.05。0.002 00.001 50.001 00.000 50bACB圖3 大鼠坐骨神經組織中CD68+和iba1+細胞的表達(200)Figure 3 The expressions of CD68+ and iba1+ cells in sciatic nerve tissue of rats (200)圖注：圖A為模型組；B為處理組；C為CD68+巨噬細胞半定量分析；D為模型組；E為處理組；F為iba1+許旺細胞半定量分析。與模型組相比，aP 0.05，bP 0.01。CD68(單位面積)模型組 處理組0.0250.0200.0150.0100.0050DFEIba1(單位面積)a模型組 處理組D0.060.040.020LFBaBAC模型組 處理組圖4 大鼠坐骨神經髓鞘染色結果(箭頭表示橫斷部位，方框內表示兩組殘余髓鞘差異，固蘭染色，40)Figure 4 The staining results of sciatic nerve myelin in rats (Luxol fast blue staining, 40)圖注：圖A為假手術組；B為模型組； C為處理組；D為髓鞘陽性染色半定量分析。與模型組相比，aP 0.05。CBA圖5 大鼠坐骨神經組織病理變化(箭頭指神經斷端,蘇木精-伊紅染色，100)Figure 5 Morphological changes of sciatic nerve tissues in rats (hematoxylin-eosin staining, 100)圖注：A為假手術組；B為模型組；C為處理組。CBA圖6 大鼠坐骨神經組織中生長相關蛋白43蛋白的表達(SP，400)Figure 6 The expression of growth-associated protein-43 in sciatic nerve tissue of rats (immunohistochemistry, 400)圖注：圖A模型組；B為處理組；C為GAP-43免疫陽性細胞半定量分析。與模型組相比，aP 0.05。0.100.080.060.040.020GAP-43I(A)a模型組 處理組3 討論 Discussion神經系統(tǒng)疾病危害人類健康，周圍神經損傷修復過程復雜，顯微外科手術可以恢復神經的連續(xù)性，但功能的恢復不盡人意。近年來，隨著神經損傷修復過程所涉及的分子機制的深入研究，從分子生物學的角度調控神經再生備受關注。最近的研究表明，在周圍神經損傷后，固有免疫系統(tǒng)通過炎性遞質參與了瓦勒變性11-12，從而影響神經再生。國外學者利用化學試劑注射以及免疫注射坐骨神經擠壓模型大鼠，使其產生局部免疫反應，研究發(fā)現(xiàn)利用上述方法處理損傷神經，神經修復時間明顯縮短，修復速度和質量有明顯提高。而作者實驗則從Toll樣受體角度，關注調控固有免疫反應對早期瓦勒變性及神經再生的影響。Toll樣受體4屬于Toll樣受體家族，是型膜受體，Toll樣受體家族由Medzhitov等13首次在果蠅體內發(fā)現(xiàn)。Toll樣受體信號通路除了識別外源性配體，也可識別內源性配體，而神經損傷部位的內源性配體可激活相應的Toll樣受體，啟動瓦勒變性過程中的先天免疫反應。在中樞神經系統(tǒng)中，小膠質細胞中Toll樣受體4表達最為豐富14-15；在外周神經系統(tǒng)中，Toll樣受體4主要表達于許旺細胞。Toll樣受體4在中樞神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，有研究顯示Toll樣受體4信號通路參與缺血再灌注腦損傷過程16，可能參與新生兒缺血缺氧性腦病的發(fā)生發(fā)展和繼發(fā)性腦損傷的免疫炎癥反應過程及腦損傷后的神經修復的調控17，亞低溫治療能通過調控Toll樣受體4信號通路減輕大鼠腦出血后血腫周圍腦組織的炎癥反應18，還有研究表明，Toll樣受體介導的神經炎性反應參與了阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化等神經變性疾病和多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展19，而在外周神經系統(tǒng)疾病的研究仍為數(shù)不多。為探討Toll樣受體4在周圍神經損傷修復過程中發(fā)揮的作用，實驗抑制大鼠體內Toll樣受體4信號通路，檢測受損神經瓦勒變性及軸突再生修復情況。TAK-242是一種的小分子化合物，可以結合Toll樣受體4受體胞內段的 Cys747 位點從而阻斷Toll樣受體4信號通路20。最近已有研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經系統(tǒng)，TAK-242能穿過血腦屏障，阻斷Toll樣受體4信號通路，調節(jié)腦缺血/再灌注損傷21，但目前尚無通過體內注射TAK-242，調控周圍神經疾病的相關報道。接下來，研究從周圍神經損傷后瓦勒變性過程中炎性因子的產生，巨噬細胞和許旺細胞募集，髓鞘碎片清除，以及軸突再生和運動功能恢復5個方面，來探究TLR4通過調節(jié)瓦勒變性對周圍神經損傷修復所產生的影響。作者利用Wistar大鼠建立坐骨神經損傷模型，首先檢測尾靜脈注射TAK-242后對大鼠坐骨神經上相關炎性因子的表達影響。在周圍神經損傷后，許旺細胞活化可分泌白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1，是Toll樣受體4信號通路下游的炎癥因子，由核因子B活化后轉位到核內15，22-23。并且有研究顯示，白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1對巨噬細胞募集和髓鞘碎片清除必不可少22，24-25。Carroll等9的研究表明在坐骨神經損傷后1.5 h已經有單核細胞趨化蛋白1mRNA的早期表達，在24 h表達量最高，因此研究在術后24 h利用實時定量PCR檢測大鼠坐骨神經組織上白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1的基因表達水平，結果顯示，在坐骨神經損傷后24 h，與假手術組相比，模型組白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1 mRNA表達明顯升高。而與模型組相比，注射TAK-242后白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1 mRNA表達明顯降低。說明周圍神經損傷后，體內注射Toll樣受體4拮抗劑可有效減少白細胞介素1和單核細胞趨化蛋白1的分泌。周圍神經損傷后，崩解的髓鞘碎片上可能存在抑制軸突再生的因子，及時清除變性的髓鞘為軸突的再生提供更有利的環(huán)境4，研究表明在周圍神經損傷后的瓦勒變性過程中，巨噬細胞被認為是清除變性神經髓鞘碎片主要細胞之一6-7，26，而以往的研究結果也表明，巨噬細胞和許旺細胞等在神經損傷后發(fā)生的瓦勒變性過程中，對促進神經組織修復和再生中發(fā)揮著不可替代的作用4。已有研究證明在神經傷后1-3 d大量的巨噬細胞聚積，而損傷后3 d是許旺細胞增殖高峰期，脫髓鞘反應于7 d左右達到峰值。因此研究在術后第3天采用免疫熒光檢測巨噬細胞和許旺細胞的募集，結果顯示與模型組相比，在神經斷端處理組CD68+細胞和iba1+細胞數(shù)均明顯降低，說明可能通過抑制Toll樣受體4通路，明顯減少瓦勒變性過程中巨噬細胞和許旺細胞的募集。同時術后第7 天坐骨神經固蘭染色表明，與模型組相比，處理組殘余髓鞘碎片明顯增加，表明處理組髓鞘碎片清除率明顯降低，與上述CD68+細胞和iba1+細胞數(shù)量減少保持一致。而術后第7 天坐骨神經蘇木精-伊紅染色也看出，模型組許旺細胞增殖活躍，吻合口有神經纖維通過，處于正常的神經斷端修復狀態(tài)，而處理組纖維再生較少，吻合口有明顯縫隙，神經斷端修復能力明顯減弱。這些結果說明了Toll樣受體4抑制劑導致受損神經斷端巨噬細胞及許旺細胞募集減少，崩解變性的髓鞘碎片清除率降低，從而使神經斷端修復能力降低。以上結果都說明，周圍神經損傷后，Toll樣受體4信號可以通過對瓦勒變性早期的免疫調控影響受損神經斷端的修復。其次，作者驗證TAK-242抑制瓦勒變性過程導致巨噬細胞和許旺細胞減少及髓鞘清除延遲后，是否會影響該過程中的軸突再生。生長相關蛋白43是內源性神經元生長依賴蛋白，參與軸突生長和突觸形成，被認為參與神經發(fā)育密切相關27，可介導再生神經纖維生長錘的黏附、生長及對再生信號的反應28，在神經系統(tǒng)發(fā)育過程或突觸重建過程中呈高表達狀態(tài)，發(fā)育完成后表達明顯降低。作者用距離神經斷端4 mm處生長相關蛋白43的表達水平來衡量軸突再生情況，Krekoski等26曾用類似的方法評價軸突再生。神經再生開始于損傷后第4天30，因此實驗在術后4 d通過免疫組織化學檢測生長相關蛋白43的表達水平，結果顯示與模型組相比，處理組生長相關蛋白43的表達水平降低，說明可能通過抑制Toll樣受體4通路，導致神經斷端巨噬細胞和許旺細胞數(shù)量減少，髓鞘碎片清除延遲，在此環(huán)境下影響了軸突再生水平?？梢酝茢?，周圍神經損傷后，Toll樣受體4信號通路可以調控瓦勒變性影響早期軸突再生，對神經損傷修復具有重要的意義。最后探究以上對瓦勒變性過程的干預是否影響后期大鼠運動功能的恢復。坐骨神經功能指數(shù)(SFI)反映下肢協(xié)調功能和肌力恢復情況，是從行為學的角度評價周圍神經功能的可靠指標。研究結果顯示，處理組大鼠在20、30和40 d坐骨神經功能指數(shù)同期均明顯低于模型組，提示抑制Toll樣受體4信號通路后最終可能影響運動功能恢復。說明周圍神經損傷后，Toll樣受體4信號通路調控瓦勒變性和軸突再生，最終可能會影響后期運動功能的恢復。實驗通過大鼠體內注射拮抗劑抑制Toll樣受體4信號通路，從對瓦勒變性早期炎性因子產生，巨噬細胞募集，髓鞘碎片清除，以及軸突再生和運動功能恢復5方面的影響，解釋了Toll樣受體4在周圍神經受損后瓦勒變性過程中的重要意義。周圍神經損傷后，究竟是哪種內源性配體引起Toll樣受體4信號的活化尚不