實(shí)驗(yàn)二 凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質(zhì)的含量.doc

實(shí)驗(yàn)二 凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質(zhì)的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1. 掌握半微量凱氏定氮法的原理。2. 熟悉利用半微量凱氏定氮法測定干酵母片中蛋白質(zhì)含量的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是含一定量氮的有機(jī)化合物，蛋白質(zhì)樣品在凱氏燒瓶中經(jīng)過濃H2SO4消化后，有機(jī)物炭化生成碳，碳將硫酸還原為SO2，本身則變成CO2，SO2使N還原為NH3，本身則氧化為S2O3而消化過程中生成H2，又加速了NH3的形成。在反應(yīng)過程中，生成的H2O和S2O3溢出，而NH3則與H2SO4結(jié)合成（NH4）2SO4存在溶液中，加入NaOH并蒸餾，使NH3溢出，用H3PO3吸收后，以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸溶液消耗的量計(jì)算樣品中的含氮量，從而可以折算出蛋白質(zhì)含量。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器1. 材料與試劑濃H2SO4、K2SO4、CuSO45H2O、NaOH、HCl、H3PO4、甲基紅、乙醇、溴甲酚綠、牛奶、定量濾紙等。40 %NaOH 溶液：40 g NaOH 溶于100 mL水中；0.05 mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)液：4.2 mL HCl 溶于1000 mL 水中，碳酸鈉法標(biāo)定鹽酸；2 % H3BO3溶液：H3BO3 2 mL 溶于100 mL 水中；加速劑：K2SO4 150 g ，CuSO45H2O 10 g 仔細(xì)混勻研磨。 甲基紅溴甲酚綠混合指示劑：甲基紅溶于乙醇配成0.1 % 乙醇溶液，溴甲酚綠溶于乙醇配成0.5 % 乙醇溶液，兩種溶液等體積混合，陰涼處保存（保存期三個(gè)月以內(nèi)）。2. 儀器消化管、小漏斗、研缽、玻璃珠、酸式滴定管、錐形瓶、天平、凱氏定氮儀等。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1. 樣品消化1）牛奶5 mL置于消化管內(nèi)，加入加速劑5 g，并沿?zé)勘诰従徏尤?0 mL濃硫酸，加入玻璃珠23粒，搖動燒瓶使全部樣品浸沒于硫酸。2）消化管放在消化爐支架上，套上毒氣罩，壓下毒氣罩鎖住二面拉鉤。3）把支架連同裝有試樣的消化管一起移至電熱爐上保持消化管在電爐中心，設(shè)定溫度在420 保持消化管中液體連續(xù)沸騰，沸酸在瓶頸部下冷凝回流。待溶液消煮至無微小碳粒、呈藍(lán)綠色時(shí)繼續(xù)消煮5 min左右。4）消化結(jié)束，將支架連同消化管一同移回消化管托底上，冷卻至室溫。注意，在冷卻過程中，毒氣罩必須保持吸氣狀態(tài)（切忌放入冷水中冷卻）放置，防止廢氣溢出。2. 樣品蒸餾 1）打開自來水給水龍頭，使自來水經(jīng)過給水口進(jìn)入冷凝管。注意水流量以保證冷凝管起到冷卻作用為止。2）開總電源開關(guān)，待紅色指示燈亮起，按一下汽按鈕待蒸汽導(dǎo)出管放出蒸汽，按消除按鈕停止加熱。3）在蒸餾導(dǎo)出管托架上，放上已經(jīng)加入適量（15 mL左右）的接受液（硼酸和混合指示劑）的錐形瓶。抬起錐形瓶支架使蒸餾導(dǎo)出管的末端浸入接受液內(nèi)。4）在消化完全冷卻后的消化管內(nèi)，逐個(gè)加入10 mL左右蒸餾水稀釋樣品。5）向下壓左側(cè)手柄，將消化管套在防濺管密封圈上，稍加旋轉(zhuǎn)使其保持接口密封，拉下防護(hù)罩。6）按一下蒸汽按鈕，開始蒸餾，到時(shí)或到量時(shí)自動停止。用洗瓶將蒸餾水沖洗接收，取下錐形瓶。7）加堿：按一下堿按鈕，NaOH溶液量必須至蒸餾液堿性顏色變黑為止。3. 滴定與計(jì)算 吸收氨后的吸收液，用標(biāo)定后的鹽酸溶液進(jìn)行滴定，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛易仙珵榈味ńK點(diǎn)。粗蛋白質(zhì)%=式中：V2樣品時(shí)消耗酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； V1滴定空白時(shí)消耗酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V試樣消解液蒸餾用體積，mL；V樣品分解液總體積，mL；C酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；K氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)，牛奶為 ；W樣品質(zhì)量，g；0.0140氮的毫克當(dāng)量數(shù)。五、思考