Transwell侵襲實(shí)驗(yàn).doc

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)前一天將ECM膠（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4冰箱中融化過夜2.實(shí)驗(yàn)時(shí)將所用的槍頭在冰上預(yù)冷半個(gè)小時(shí)，ECM膠用預(yù)冷的無血清1640按1：9稀釋（稀釋至1mg/ml），每孔中加入稀釋好的ECM膠40l，放入37培養(yǎng)箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中殘余液體，每孔加入70ul含無血清1640培養(yǎng)液，37，30min，吸去培養(yǎng)基4.對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，0.1%血清1640懸浮，計(jì)數(shù)，稀釋至密度為1106/ml，每空中加200l細(xì)胞懸液5.24孔板下室一般加入600l含30%新生牛血清的1640培養(yǎng)基6.24h后，棄去孔中培液，PBS洗2遍，甲醇固定20分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞7.400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)個(gè)人覺得做Transwell就像小馬過河一樣，要講究個(gè)體化，不同的細(xì)胞侵襲能力不同，膠的稀釋倍數(shù)、細(xì)胞上樣量、上下室血清濃度差以及孵育時(shí)間也不同。對(duì)于你的問題，我覺的不管是在溫箱中放5個(gè)小時(shí)或者是在超靜工作臺(tái)中風(fēng)干，其主要目的是為了讓Matrigel從液體狀變成膠凍狀，在溫箱中放置5個(gè)小時(shí)后，拿出來上室中肯定會(huì)有液體殘留，此時(shí)一定要將殘留的液體洗干凈，然后在水化一下基底膜。(1) 吸去培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦除上室聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面貼壁細(xì)胞，用0.01MPBS漂洗兩次，4%多聚甲醛固定10 分鐘；(2) 吸去固定液，將膜風(fēng)干，每孔加0.6ml 0.1%結(jié)晶紫染液，室溫中放置20 分鐘；(3) 輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將上室取出，從聚碳酸酯膜內(nèi)側(cè)面用吸水紙吸干水分，自然干燥；(4) 測定前，將各實(shí)驗(yàn)組上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33醋酸脫色，充分振蕩，每組設(shè)定5 復(fù)孔；同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（33醋酸）；比色：每孔取脫色液150l 加入96 孔板中，在570nm 處測定OD 值。2步驟21 Transwell小室制備211 無基質(zhì)膠Transwell小室制備 包被基底膜（冰浴操作）：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面。24孔板每空50-70uL:20uL Matrigel + 160uL DMEM/F-124風(fēng)干，過夜。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37，30min。另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝膠。212 有基質(zhì)膠的Transwell小室制備Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300l預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置1530min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。22 制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至110105，個(gè)人認(rèn)為不要超過5105。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)采用密度要自己摸索，因?yàn)椴煌?xì)胞，其侵襲能力是不同的。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會(huì)過多過快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話將難以計(jì)數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。個(gè)人認(rèn)為，對(duì)照組和處理盡量不要分開計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的差異會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果需要對(duì)細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計(jì)數(shù)，那么計(jì)數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準(zhǔn)確，盡量保證對(duì)照組和處理組細(xì)胞密度一致。23 接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100200l加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，請(qǐng)參考說明書。24孔板小室一般200l。 24孔板下室一般加入500l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。以我的課題為例，我使用的藥物不僅會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力，還對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制。我選擇的藥物濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個(gè)濃度處理細(xì)胞，24h內(nèi)對(duì)細(xì)胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個(gè)濃度來做Transwell，處理時(shí)間也必須限定在24h內(nèi)，否則一旦藥物抑制了細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對(duì)照組，那么就難以肯定穿過膜的細(xì)胞比對(duì)照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就比對(duì)照組少而引起的了。時(shí)間過長不可以，同樣，過短也不行，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)會(huì)有一定量的MMPs儲(chǔ)存，短時(shí)間內(nèi)可能侵襲能力不會(huì)有太大改變。同時(shí)從藥物被吸收進(jìn)去，進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個(gè)過程。時(shí)間點(diǎn)的選擇可盡量長點(diǎn)，也可選擇多個(gè)時(shí)間點(diǎn)研究時(shí)間依賴效應(yīng)，但前提是這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不能有明顯變化。另外，我看到細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過會(huì)聚集成團(tuán)，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象在培養(yǎng)過程中，膜下會(huì)逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時(shí)間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時(shí)發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴(yán)重。因此，個(gè)人建議，最好接種細(xì)胞后12h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。 24 結(jié)果統(tǒng)計(jì)檢測穿過的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：241 直接計(jì)數(shù)法2411 “貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去。通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺(tái)肦藍(lán)染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。個(gè)人推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢：(1). 不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(2). 配制簡單方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm 測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。個(gè)人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。因?yàn)椋m然經(jīng)過準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，往往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制，可能某一批實(shí)驗(yàn)穿過的細(xì)胞會(huì)特別多，以致細(xì)胞成堆，這種情況下就難以計(jì)數(shù)了，這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀檢測。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會(huì)染不上。 細(xì)胞計(jì)數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細(xì)胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點(diǎn)浪費(fèi)。取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。論壇里一般采用35個(gè)視野，也有人用10個(gè)，都是隨機(jī)選取，個(gè)人認(rèn)為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會(huì)摻進(jìn)人為影響，特別是計(jì)數(shù)視野較少的時(shí)候。我選取16個(gè)視野，不是隨機(jī)選擇，而是有固定的位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。不同廠家不同型號(hào)的小室，膜的面積不盡相同，但個(gè)人認(rèn)為，拍照時(shí)還是應(yīng)當(dāng)選取固定的位置，并選擇盡可能多的視野。2412 “非貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時(shí)細(xì)胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進(jìn)下室。這種情況我沒有遇到過，根據(jù)論壇里提供的經(jīng)驗(yàn)，可以收集下層培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)細(xì)胞量，也可用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法直接在鏡下計(jì)數(shù)，個(gè)人認(rèn)為MTT應(yīng)該也是可以用的，有興趣的可以試試看。 241 間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用于穿過細(xì)胞過多，而無法通過計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。2411 MTT法 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞 24孔板中加入500l含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37 4h后取出。 24孔板中加入500l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲臜充分溶