色譜法葉綠素分離實驗.ppt

第8章經(jīng)典色譜分離實用技術(shù) 學(xué)習(xí)目標(biāo)知識目標(biāo)掌握吸附薄層色譜和紙色譜分離原理 常用分離參數(shù)和系統(tǒng)適用性指標(biāo) 熟悉經(jīng)典柱色譜 薄層色譜和紙色譜操作方法 了解色譜的分類和吸附薄層色譜 紙色譜 經(jīng)典柱色譜的色譜條件選擇原則 技能目標(biāo)掌握吸附柱色譜制備技術(shù)和薄層板制備 點樣 展開和顯色檢視等操作技術(shù) 熟悉薄層色譜 紙色譜的儀器和材料 了解紙色譜和經(jīng)典柱色譜的操作規(guī)程 第1節(jié)色譜法概述 一 色譜法 Tswett葉綠素分離實驗 1 色譜 植物色素經(jīng)溶劑沖洗分離后如同白光色散成七色光帶的現(xiàn)象 2 色譜法 用于產(chǎn)生色譜的分離方法 3 色譜柱 chromatographiccolumn 裝有用于分離的填充物的細(xì)長管 如玻璃管 不銹鋼管 4 固定相 stationaryphase 5 流動相 mobilephase 液體流動相氣體流動相超臨界流體流動相 固體固定相液體固定相 6 色譜分離本質(zhì) 利用混合物中各組分在流動相和固定相之間相互作用力 如溶解能力 吸附力 極性 親和力等 的強弱不同 而使各組分在色譜柱中分別以不同的速度移動而達(dá)到分離的定性與定量分析的方法 二 色譜法分類 1 流動相狀態(tài) 液相色譜 LC 氣相色譜 GC 超臨界流體色譜 SFC 液 固色譜 LSC 液 液色譜 LLC 氣 固色譜 GSC 氣 液色譜 GLC 2 按分離原理分類 吸附色譜分配色譜 DC 離子交換色譜 IEC 分子排阻色譜 MEC 親和色譜 3 根據(jù)實驗操作形式 柱色譜 CC 平面色譜 PC 薄層色譜 TLC 紙色譜 PC 薄膜色譜 TFC 三 色譜法的特點 分離效能高 分離與分析功能兼?zhèn)?自動化程度高 應(yīng)用范圍廣 第2節(jié)經(jīng)典柱色譜技術(shù) 一 液 固吸附柱色譜技術(shù) 1 分離原理 1 液 固吸附柱 色譜法固定相是固體吸附劑 流動相為液體的柱色譜法 2 分離機制 吸附劑表面對不同組分吸附力的不同和流動相對各組分的溶解能力 或稱解吸能力 洗脫能力 的差異 最終導(dǎo)致混合物中各組分流出色譜柱的先后順序 或在色譜柱中停留的時間即保留時間 不同而達(dá)到分離 3 應(yīng)用 分離酸性及中性化合物 如醇類和芳香烴等 2 吸附劑 1 硅膠 SiO2 XH2O A 吸附機制 表面有許多硅羥基 Si OH 的氫鍵作用B 吸附活性C 失活或脫活D 活化 硅膠活性與含水量的關(guān)系 2 氧化鋁 A 吸附機制 其表面鋁羥基 Al OH 的氫鍵作用B 活性 C 氧化鋁分類及應(yīng)用范圍 3 聚酰胺 A 吸附機制 通過分子內(nèi)的酰胺基與酚 酸 硝基 醌類化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用B 應(yīng)用范圍 適合于含 OH的天然產(chǎn)物的有效成分分離 4 大孔吸附樹脂 A 吸附機制 大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物 不溶于酸 堿及有機溶劑 吸附性與篩分性原理相結(jié)合B 應(yīng)用范圍 主要用于水溶性化合物 如皂苷 的分離純化 3 流動相 又稱為洗脫劑 1 流動相影響因素A 被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu) 性質(zhì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)常見官能團(tuán)的極性由小到大的順序是 烷烴 烯烴 醚類 硝基化合物 酯類 酮類 醛類 硫醇 胺類 酰胺 醇類 酚類 羧酸類 B 流動相極性 相似相溶C 吸附劑活性 官能團(tuán)極性與數(shù)目結(jié)構(gòu)空間排列 2 如何選擇流動相 最佳方案總是實驗確定 想一想在吸附色譜中 以硅膠為固定相 當(dāng)用三氯甲烷為流動相時 樣品中某些組分保留時間太短 若改用三氯甲烷 甲醇 1 1 時 則樣品中各組分的保留時間是變長 還是變得更短 為什么 4 吸附柱色譜操作技術(shù) 1 裝柱A 質(zhì)量要求裝柱之前 先將空柱洗凈干燥 再將空柱垂直固定在鐵架臺上 如果色譜柱下端沒有砂芯橫隔 就取一小團(tuán)脫脂棉 用玻璃棒將其推至柱底 再在上面平鋪上一層厚0 5 1cm的洗過 干燥石英砂 有助于分離時色層邊緣整齊 加強分離效果 柱的長度與直徑比一般為10 20 1 色譜柱的填裝要均勻 不能有氣泡 B 裝法 濕法裝柱 干法裝柱 2 加樣 干法加樣 濕法加樣 3 洗脫 洗脫劑一種溶劑或幾種溶劑按一定比例組成混合溶劑 操作要求A 保持吸附層上方有一定量的洗脫劑 防止斷層和旁流B 控制洗脫劑的流速 5 10滴 min 4 收集 等份收集 亦可用自動收集器 按變換洗脫劑收集 5 檢驗可以為后續(xù)操作 二 凝膠柱色譜技術(shù) 1 分離原理 1 凝膠 2 分離原理凝膠的孔穴大小與被分離組分大小相當(dāng) 尺寸大的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi) 但進(jìn)不了小孔 甚至于完全被排斥先流出色譜柱 尺寸小的組分分子 大孔小孔都可以滲進(jìn)去 最后流出 2 固定相 1 無機凝膠又稱硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠 多孔玻璃珠性能 化學(xué)惰性 穩(wěn)定性及機械強度均好 耐高溫 使用壽命長 但裝柱時易碎 不易裝緊 柱分離效能較低 2 有機凝膠又稱半硬質(zhì)凝膠性能 能耐較高壓力 適用于有機溶劑作流動相 有一定可壓縮性 可填得緊密 柱分離效能較高 但在有機溶劑中有輕度膨脹 3 新型凝膠 葡萄聚糖凝膠 3 流動相 1 要求流動相必須與凝膠本身非常相似 能溶解樣品 浸潤凝膠 且具有較低的黏度 有利于大分子的擴散 2 選用方法水溶性樣品 水溶液為流動相非水溶性樣品 有機溶劑為流動相 3 常用的流動相四氫呋喃 甲苯 N N 二甲基甲酰胺 三氯甲烷和水等 4 凝膠柱色譜操作技術(shù) 1 溶脹 2 裝柱 3 加樣 4 洗脫 5 再生用恰當(dāng)?shù)姆椒ǔツz中的污染物 使其恢復(fù)其原來的性質(zhì)交聯(lián)葡萄糖凝膠 溫?zé)岬? 5mol L氫氧化鈉和0 5mol L的氯化鈉的混合液浸泡 用水沖洗到中性聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠 鹽溶液浸泡 用水沖到中性 第3節(jié)薄層色譜分離檢測技術(shù) 一 分離原理薄層色譜是一種開放性色譜 是將混合組分樣品溶液點在薄層板一端的起始線上 點樣處稱為原點 在密閉容器中用適宜的流動相 薄層色譜法中又稱為展開劑 展開 因吸附劑對不同組分的吸附能力不同 展開劑對不同組分的解吸能力也不完全相同 造成各組分在薄層析上移動的速度有快有慢 經(jīng)過一段時間展開后 不同的組分彼此分開 最終形成相互分離的斑點 薄層色譜法 thinlayerchromatography TLC 將固定相均勻平鋪在光潔表面的玻璃 塑料或金屬板上形成薄層 在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法可分為吸附 分配 分子排阻色譜法等 二 薄層色譜參數(shù) 1 比移值 1 定義組分遷移的距離與展開劑遷移的距離之比 2 計算方法 2 相對比移值 1 定義指被測組分的比移值與參照組分的比移值之比 2 計算方法 3 特點消除系統(tǒng)誤差 值的重復(fù)性和可靠性都比好 3 分離度 1 定義衡量薄層色譜分離效果的重要指標(biāo) 是指相鄰兩斑點中心至原點的距離之差與兩斑點平均徑向?qū)挾?徑向?qū)挾仁侵赴唿c沿著展開方向的寬度 的比值 2 計算方法 三 儀器與材料 1 吸附劑 粒徑5 40 硅膠 聚酰胺 微晶纖維素 氧化鋁 硅藻土 常用 硅膠H硅膠G硅膠GF254硅膠HF254 想一想H G F各代表何種意思 試解釋硅膠HF365 2 載板 種類 要求表面光滑 平整清潔 玻板處理措施清潔劑或鉻酸洗液浸泡洗滌 用清水充分清洗 再用蒸餾水或去離子水沖洗 表面應(yīng)不附水珠 晾干備用 3 點樣器 手動 全自動點樣儀 定量毛細(xì)管 平口微量注射器 3 展開容器 平底色譜專用展開缸 雙槽薄層色譜專用展開缸 4 顯色劑 5 顯色裝置 噴霧瓶 浸漬槽 蒸氣熏蒸 雙槽展開缸 6 檢視裝置 紫外分析儀 三用 攝像設(shè)備 薄層色譜掃描儀 CS9301型 四 操作技術(shù) 1 薄層板制備 自制薄層板 市售薄層板 無黏合劑 分類 含黏合劑 10 15 煅石膏 0 2 0 5 羧甲基纖維素鈉水溶液 操作方法 普通薄層板 玻璃 聚酰胺薄膜和鋁基 高效薄層板 固定相粒徑為5 7 分類 操作方法臨用前一般應(yīng)在110 活化30分鐘 聚酰胺薄膜不需活化 鋁基片薄層板和聚酰胺薄膜可根據(jù)需要剪裁 操作方法 將1份固定相和3份水 或羧甲基纖維素鈉水溶液 在研缽中沿同一方向研磨混勻 去除表面的氣泡后 置玻璃板上使涂布均勻 或倒入涂布器 見圖8 14 中 在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器進(jìn)行涂布 涂層厚度為0 2mm 0 3mm 取涂好的薄層板 置水平臺上于室溫下晾干后 在110 活化30分鐘 立即置于有干燥劑的干燥器中備用 手動涂布器 2 點樣 普通板點樣基線 距底邊2 0cm圓點狀 R 3mm條帶狀 寬度5 10mm點或條帶間距 8mm點樣量 10 高效板點樣基線 距底邊0 8 1cm圓點狀 R 2mm條帶狀 寬度4 8mm點或條帶間距 5mm點樣量 5 3 展開 1 展開要求 查閱A 何為邊緣效應(yīng) 何因 如何防止 B 展開劑加入量 展開劑展開距離 2 展開方式 上行近水平雙向多次 上行展開 近水平展開 五 檢測技術(shù) 1 系統(tǒng)適用性試驗 檢測靈敏度 比移值 分離效能 2 鑒別 等濃度對照法 同板 大致同位 同大 同色澤 等體積混合法 斑點單一 緊密 結(jié)構(gòu)相似對比法 Rf不同或兩斑點 4 定量方法 1 目視比色法 半定量法 精度 10 2 斑點洗脫法 3 薄層掃描法 正在減少使用 第4節(jié)紙色譜分離技術(shù) 一 分離原理 液 液萃取 利用樣品中不同組分在兩相溶劑中溶解性 或分配系數(shù) 不同 當(dāng)流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相 被吸附或固定在惰性材料上的液體 時 各組分在兩相間不斷進(jìn)行溶解 萃取 再溶解 再萃取 樣品經(jīng)過多次反復(fù)分配后 造成分配系數(shù)稍有差異的組分移行的距離不同面實現(xiàn)分離 二 儀器與材料 1 色譜濾紙 想一想 色譜濾紙如何選擇 2 展開劑 1 紙色譜固定相一般是什么 2 紙色譜展開劑如何選擇 3 展開容器圓形或長方形玻璃缸 缸上具有磨口玻璃蓋且能密閉 下行紙色譜展開缸 三 操作技術(shù) 1 色譜濾紙的準(zhǔn)備 1 用于下行法的色譜濾紙 2 用于上行法的色譜濾紙 2 點樣樣品溶解于適宜的溶劑中制成一定濃度的溶液 用定量毛細(xì)管或微量注射器吸取溶液 點于點樣基線上 溶液宜分次點加 每次點加后 俟其自然干燥 低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈?點樣直徑為2mm 4mm 點樣量取決于色譜濾紙的薄厚程度和顯色劑的靈敏度 一般幾到幾十微克 點間距離約為1 5cm 2 0cm 樣點通常為圓形 也可點成條形 3 展開 紙色譜下行展開 紙色譜上行展開 4 斑點定位 紙色譜法斑點的定位基本和薄層色譜法相似 但紙色譜法不能使用腐蝕性顯色劑 也不能在高溫下顯色 運用紙色譜進(jìn)行藥物的鑒別 檢查和含量測定的方法 要求與薄層色譜法一致 第5節(jié)應(yīng)用案例 一 柱色譜法的應(yīng)用案例 案例8 1黃芪含量測定中樣品溶液的制備 1 黃芪中主要活性成分是什么 如何提取和純化 2