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國家自然科學(xué)基金申請書 2010版申請代碼H1606受理部門 收件日期受理編號國家自然科學(xué)基金申 請 書(2010版) 您現(xiàn)在不能檢查保護文檔或打印文檔，請根據(jù)以下三個步驟操作： 1)如果您是Word2000,word XP, word 2003或以上版本用戶，請把Word宏的安全性設(shè)為:中 方法: Word菜單-工具-宏-安全性-安全級,設(shè)置為中 (如果您是Word97用戶，繼續(xù)執(zhí)行以下步驟) (如果您是Office2007用戶，點擊word左上角安全警告處選項中的啟用此內(nèi)容) 2)關(guān)閉本文檔，重新打開本文檔 3)點擊啟用宏按鈕，即可開始填寫本文檔或打印了資助類別：面上項目亞類說明： 附注說明： 項目名稱：Pyk2促進肝癌細胞遷移的一個新的分子機制研究：結(jié)合并磷酸化E-cadherin?申 請 人： 電話：依托單位：通訊地址：郵政編碼：266021 單位電話：電子郵箱： 申報日期： 2010年2月26日國家自然科學(xué)基金委員會基本信息yoKWT/OQ申 請 人 信 息姓名性別男出生年月1973年4月民族漢族學(xué)位博士職稱副主任醫(yī)師每年工作時間（月）8 電話電子郵箱傳真 國別或地區(qū)中國個人通訊地址工作單位主要研究領(lǐng)域腫瘤分子生物學(xué) 依托單位信息名稱聯(lián)系人電子郵箱電話網(wǎng)站地址合作研究單位信息單 位 名 稱項 目 基 本 信 息項目名稱資助類別面上項目 亞類說明 附注說明 申請代碼H1606:腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移H1617:消化系統(tǒng)腫瘤基地類別 研究年限2011年1月 2013年12月研究屬性基礎(chǔ)研究 申請經(jīng)費35.0000萬元摘 要(限400字)：E-cadherin的喪失與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其喪失的主要原因是由于其酪氨酸殘基被磷酸化后蛋白被降解。我們通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)一個新的能與E-cadherin相互作用的非受體型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增強可促進肝癌細胞遷移。本課題假設(shè)Pyk2結(jié)合并磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin蛋白降解，細胞遷移性增加。本課題設(shè)計首先通過GST pulldown、免疫共沉淀證明二者相互作用可靠；其次通過磷酸化實驗確證Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后應(yīng)用細胞遷移實驗和裸鼠成瘤實驗確定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin而影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移；最后分析在人肝癌標(biāo)本中二者表達的相關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促進肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移，具有國際先進性。這對于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機制有新的理解，對于藥物研發(fā)提供新的思路。關(guān) 鍵 詞(用分號分開，最多5個)肝癌；E-cadherin；Pyk2；腫瘤轉(zhuǎn)移 第 4 頁 版本1.003.356經(jīng)費申請表 （金額單位：萬元）科目申請經(jīng)費備注（計算依據(jù)與說明）一.研究經(jīng)費28.75001.科研業(yè)務(wù)費7.6000（1）測試/計算/分析費2.1000DNA測序，生物信息分析，統(tǒng)計分析（2）能源/動力費（3）會議費/差旅費1.0000參加學(xué)術(shù)會議3-4人次（4）出版物/文獻/信息傳播費3.0000文獻檢索，發(fā)表論文，專利申請（5）其他1.5000成果鑒定2.實驗材料費21.1500（1）原材料/試劑/藥品購置費17.1500各種試劑盒，脂質(zhì)體，抗體，細胞培養(yǎng)，實驗耗材（2）其他4.0000動物飼養(yǎng)，臨床調(diào)研3.儀器設(shè)備費0.0000（1）購置（2）試制4.實驗室改裝費5.協(xié)作費二.國際合作與交流費1.50001.項目組成員出國合作交流2.境外專家來華合作交流1.5000邀請美國康奈爾大學(xué)關(guān)軍林教授合作交流三.勞務(wù)費3.0000研究生加班補貼四.管理費1.75005%管理費合 計35.0000與本項目相關(guān)的其他經(jīng)費來源國家其他計劃資助經(jīng)費其他經(jīng)費資助（含部門匹配）其他經(jīng)費來源合計0.0000報告正文第 18 頁 一、立項依據(jù)與研究內(nèi)容： （一）項目的立項依據(jù)原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國的肝癌發(fā)病數(shù)占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我國對于肝癌的研究顯得非常迫切1。肝癌非常容易轉(zhuǎn)移，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因。了解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制，對于設(shè)計合理的治療藥物，進一步提高我國肝癌的治療水平具有重要意義2。E-cadherin在肝癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中起到了不可忽視的作用。E-cadherin屬于鈣粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在調(diào)節(jié)細胞與細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的粘附反應(yīng)，介導(dǎo)細胞間的接觸抑制和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。E-cadherin與-catenin、p120等形成復(fù)合體發(fā)揮上述功能3。E-cadherin與多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān) 4-5 。有人認(rèn)為提高E-cadherin的表達可以成為腫瘤治療的一個方向6。與其他腫瘤類似，研究表明E-cadherin在肝細胞癌的陽性率顯著低于癌旁組織及正常肝組織，表達越低則腫瘤病理分級越差，也越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移7-9。有人報道缺乏E-cadherin表達的人肝癌細胞株非常容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，但是轉(zhuǎn)染E-cadherin后這種特性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說明E-cadherin在肝癌細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用10。E-cadherin喪失或低表達的機制至今仍然不是完全清楚。目前認(rèn)為可能是由于基因突變導(dǎo)致功能喪失、啟動子甲基化后轉(zhuǎn)錄沉默11以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亞洲人群中基因突變和啟動子甲基化都不常見12-13 。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文獻證明，酪氨酸殘基磷酸化的E-cadherin能夠與Hakai（一種E3泛素連接酶）結(jié)合，使其泛素化而降解14 。那么有多少酪氨酸激酶參與這個機制呢？有報道EGFR，IGF-1R能夠磷酸化E-cadherin。對于E-cadherin磷酸化的調(diào)節(jié)機制目前仍然不是非常明確。為了解E-cadherin在肝癌細胞的分子信號通路，我們以E-cadherin（胞內(nèi)段）為誘餌應(yīng)用酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）在肝臟的cDNA文庫中篩選到一個新的能與E-cadherin相互作用的非受體型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin并調(diào)節(jié)細胞遷移呢？Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一種富含脯氨酸的非受體型酪氨酸蛋白激酶，與FAK同源度較高，屬于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在調(diào)節(jié)細胞存活、增殖和遷移16方面受到越來越多的關(guān)注。Pyk2信號通路的活化能夠增強細胞運動和遷移，研究發(fā)現(xiàn)Pyk2在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用17-18。其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌組織中表達上調(diào)， Pyk2高表達與肝癌組織體積、Edmonson分級呈正相關(guān)， Pyk2表達越高病人預(yù)后越差。動物實驗顯示在侵襲邊緣的肝癌細胞和轉(zhuǎn)移到肺結(jié)節(jié)中的肝癌細胞均發(fā)現(xiàn)Pyk2高表達。肝癌細胞株轉(zhuǎn)染Pyk2后，其遷移功能增強；而用裸鼠做實驗發(fā)現(xiàn)抑制Pyk2的活性后肝癌腫瘤的大小和肺轉(zhuǎn)移率都較對照明顯減少19-20。Pyk2調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機制是什么呢？有研究表明，在肝癌細胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，與c-Src形成復(fù)合體激活ERK通路，從而增強肝癌細胞的侵襲性19-20；也有報道Pyk2與 PECAM-1（血小板/內(nèi)皮細胞粘附分子，與E-cadherin一樣都屬于鈣粘附蛋白家族）結(jié)合并且都影響腫瘤細胞的侵襲性21 ；還有報道RhoC通過激活Pyk2促進前列腺癌轉(zhuǎn)移18以及與SOCS3、Cyr61有關(guān)等 22-23?？偠灾?，目前Pyk2調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的具體機制仍不十分清楚。Pyk2與E-cadherin能否結(jié)合并調(diào)節(jié)肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移呢？這是我們想要研究的問題。我們繼續(xù)應(yīng)用酵母雙雜交反復(fù)驗證、GST-Pulldown實驗、免疫共沉淀證明二者相互作用是可靠的（具體結(jié)果見研究基礎(chǔ)）。那么，現(xiàn)在的問題是二者在體內(nèi)狀態(tài)下是否結(jié)合？結(jié)合后的調(diào)節(jié)機制是什么？二者的結(jié)合位點在什么地方？結(jié)合后如何調(diào)節(jié)細胞遷移以及影響腫瘤轉(zhuǎn)移？考慮到Pyk2是一個激酶蛋白，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)E-cadherin與Pyk2的激酶部分結(jié)合，因此有兩種可能性。一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。有文獻報道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成員）并且抑制其與Catenin，P120等形成復(fù)合體24-25。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)該也有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動因素的作用，Pyk2表達增多，活性增強，從而磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin降解，最終使細胞遷移性增強。但是也不能排除第二種可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，從而導(dǎo)致腫瘤細胞侵襲性下降。申請人以前的工作就發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一個成員- Protocadherins能夠抑制Pyk2的活性26，申請人做這方面工作時曾取E-cadherin做對比參照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Pyk2激酶活性不是很明顯（本數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此不支持第二種可能性。二者具體如何調(diào)節(jié)還需要進一步實驗來證實。本課題的設(shè)計主要是為了解答上述問題。首先在前期工作基礎(chǔ)上繼續(xù)明確Pyk2與E-cadherin能相互作用以及調(diào)節(jié)機制；其次應(yīng)用細胞遷移實驗確定二者的調(diào)節(jié)對腫瘤細胞遷移、侵襲性的影響；然后應(yīng)用裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實驗明確二者的調(diào)節(jié)在對肝癌遠處轉(zhuǎn)移的影響；最后分析在肝癌病人組織標(biāo)本中二者表達的相關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本課題在國際上最新發(fā)現(xiàn)Pyk2與E-cadherin直接相互作用，并且確定其結(jié)合機制，明確這種調(diào)節(jié)與肝癌細胞遷移力和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。這對于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機制有新的理解。許多新型抗癌藥物如赫賽汀、格列衛(wèi)、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶為治療靶點，取得非常好的療效。本研究對于確定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做為分子治療靶點、設(shè)計合理的治療藥物可以提供更有利的素材。參考文獻：1 He J, Gu D, Wu X, et al. Major causes of death among men and women in China. N Engl J Med 2005;353:112434.2 吳孟超，廖美琳，陸嘉德 常見惡性腫瘤治療進展 上海 科技教育出版社20073 Bryant DM, Stow JL. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends Cell Biol. 2004 Aug;14(8):427-344 Wells A, Yates C, Shepard CR. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 2008;25(6):621-8. Epub 2008 Jul 45 Salon C, Lantuejoul S, Eymin B, et al. The E-cadherin-beta-catenin complex and its implication in lung cancer progression and prognosis. Future Oncol. 2005 Oct;1(5):649-606 Howard EW, Camm KD, Wong YC, et al. E-cadherin upregulation as a therapeutic goal in cancer treatment. Mini Rev Med Chem. 2008 May;8(5):496-518.7 Guo C, Liu QG, Yang W, et al. Relation among p130Cas, E-cadherin and beta-catenin expression, clinicopathologic significance and prognosis in human hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2008 Oct;7(5):490-6.8 Zhai B, Yan HX, Liu SQ, et al. Reduced expression of E-cadherin/catenin complex in hepatocellular carcinomas. World J Gastroenterol. 2008 Oct 7;14(37):5665-73.9 Fransvea E, Angelotti U, Antonaci S, et al. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 2008 May;47(5):1557-66.10 Osada T, Sakamoto M, Ino Y, et al. E-cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 1996 Dec;24(6):1460-711 Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a), p27(Kip1) and E-cadherin in carcinogenesis. Oral Oncol. 2006 Jan;42(1):5-13.12 Wei Y, Van Nhieu JT, Prigent S, et al. Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma: Correlations with genetic alterations, -catenin expression, and clinical features Hepatology2002 Sep;36(3):692-70113 Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:2914 Fujita Y, Krause G, Scheffner M,Hakai, et al. Hakai, a c-Cbl-like protein, ubiquitinates and induces endocytosis of the E-cadherin complex. Nat Cell Biol. 2002 Mar;4(3):222-31.15 McLachlan R W, Yap A S. Not so simple: the complexity of phosphotyrosine signaling at cadherin adhesive contacts. J Mol Med 2007 85:545-554.16 Avraham H, Park SY, Schinkmann K, et al. RAFTK/Pyk2-mediated cellular signalling. Cell Signal. 2000 Mar;12(3):123-33. 17 Behmoaram E, Bijian K, Jie S, et al. Focal adhesion kinase-related proline-rich tyrosine kinase 2 and focal adhesion kinase are co-overexpressed in early-stage and invasive ErbB-2-positive breast cancer and cooperate for breast cancer cell tumorigenesis and invasiveness. Am J Pathol. 2008 Nov;173(5):1540-50. 18 Iiizumi M, Bandyopadhyay S, Pai SK, et al. RhoC promotes metastasis via activation of the Pyk2 pathway in prostate cancer. Cancer Res. 2008 Sep 15;68(18):7613-20.19 Sun CK, Man K, Ng KT, et al. Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) promotes proliferation and invasiveness of hepatocellular carcinoma cells through c-Src/ERK activation. Carcinogenesis. 2008 Nov;29(11):2096-105.20 Sun CK, Ng KT, Sun BS, et al. The significance of proline-rich tyrosine kinase2 (Pyk2) on hepatocellular carcinoma progression and recurrence. Br J Cancer. 2007 Jul 2;97(1):50-7. 21 Zhang X, Xu LH, Yu Q. Cell aggregation induces phosphorylation of PECAM-1 and Pyk2 and promotes tumor cell anchorage-independent growth. Mol Cancer. 2010 Jan 14;9:7 22 Zhang S, Guo D, Jiang L, et al. SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2 signaling in vitro. BMC Cancer. 2008;8:150.23 Vitale G, Gentilini D, Abbruzzese A, et al. Pyk2 and Cyr61 at the cross-road of cAMP-dependent signalling in invasiveness and neuroendocrine differentiation of prostate cancer. Cancer Biol Ther. 2009;824 Turowski P, Martinelli R, Crawford R, et al. Phosphorylation of vascular endothelial cadherin controls lymphocyte emigration. J Cell Sci. 2008 Jan 1;121(Pt 1):29-37.25 Potter MD, Barbero S, Cheresh DA. Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of p120- and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem. 2005 Sep 9;280(36):31906-12.26 Jian Chen, Lu Y, Meng S, et al. alpha- and gamma-Protocadherins Negatively Regulate PYK2. J Biol Chem. 2009 Jan 30;284(5):2880-90 （二）項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。.主要研究內(nèi)容1）確定E-cadherin與Pyk2體外、體內(nèi)相互作用、作用位點以及調(diào)節(jié)關(guān)系。A取E-cadherin與Pyk2不同結(jié)構(gòu)域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法確定二者相互作用的結(jié)構(gòu)域，以及作用位點。B.選取二者表達量都適中的肝癌組織，行內(nèi)源性免疫共沉淀，證明在體內(nèi)二者也相互作用。C.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和蔗糖密度梯度超速離心方法分析細胞組分的方法確定E-cadherin與Pyk2在細胞中共定位。D.應(yīng)用磷酸化實驗，確定E-cadherin是否是Pyk2的底物，應(yīng)用定點突變的方法，確定酪氨酸的磷酸化位點。（同時再次確證E-cadherin能否影響Pyk2激酶活性。）2）從細胞水平確定Pyk2對E-cadherin的調(diào)節(jié)影響細胞遷移。A.篩選Pyk2穩(wěn)定表達細胞株，然后應(yīng)用Transwell細胞遷移實驗觀察過表達Pyk2的細胞其遷移性、侵襲性的變化，檢測過表達Pyk2時E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的變化，確定Pyk2對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)影響細胞遷移。B.取高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株MHCC97-H 、HCCLM3 (購自上海中山醫(yī)院肝癌研究所)，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Pyk2的表達，觀察細胞遷移性、侵襲性的變化，檢測相應(yīng)狀態(tài)下E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和表達水平的變化。從相反方向確定Pyk2的表達抑制后對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，以及這種調(diào)節(jié)對細胞遷移的影響。3）從動物模型水平確定Pyk2對E-cadherin的調(diào)節(jié)影響腫瘤轉(zhuǎn)移。應(yīng)用Pyk2穩(wěn)定表達細胞株接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移肝轉(zhuǎn)移情況，分析Pyk2的過表達對E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)關(guān)系，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4）從肝癌病人標(biāo)本中尋找Pyk2與E-cadherin磷酸化狀態(tài)的相關(guān)性，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的的相關(guān)性。收集肝癌標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化和Western等方法確定Pyk2的表達水平的變化與E-cadherin磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的相關(guān)性，以及二者與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。.研究目標(biāo)1）確定Pyk2結(jié)合E-cadherin相互作用的結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點，并闡明其調(diào)節(jié)機制。2）確定Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)可影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。.擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題E-cadherin酪氨酸殘基的磷酸化導(dǎo)致其被降解，增加細胞侵襲性。本課題能夠確定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)是否是調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的新的分子機制。（三）擬采取的研究方案及可行性分析。.研究方法GST-pull down，熒光共定位，內(nèi)源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速離心，磷酸化實驗，定點突變，穩(wěn)定表達細胞株的篩選，RNAi抑制Pyk2表達，細胞遷移、侵襲實驗，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實驗，免疫組化，定量PCR，Western檢測等。.關(guān)鍵技術(shù)說明：1）磷酸化實驗首先應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為陽性參照，以純化的GST-E-cadherin蛋白為底物，以GST蛋白作為陰性對照，觀察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin則應(yīng)用生物信息分析，定點突變，尋找磷酸化位點；如果不能磷酸化E-cadherin，則以通用底物E4Y1作為底物，加入不同量的E-cadherin觀察是否可以影響Pyk2的激酶活性。2）細胞遷移實驗首先分別用空載體PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc轉(zhuǎn)染肝癌細胞株（PRNK為Pyk2的C段，為Pyk2的失活突變體），用G418篩選出穩(wěn)定表達細胞株。并檢測穩(wěn)定表達細胞株P(guān)yk2蛋白表達量的不同。然后應(yīng)用穩(wěn)定表達細胞株做Transwell細胞遷移和侵襲實驗，比較細胞遷移率的變化；檢測細胞遷移率的變化與Pyk2蛋白表達量的關(guān)系。同時取相應(yīng)細胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化以及這些變化與腫瘤遷移的關(guān)系，與Pyk2蛋白表達量的關(guān)系。3）裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實驗取上述三組穩(wěn)定表達細胞株分別接種裸鼠，待腫瘤直徑約1-1.5cm時取出腫瘤重新接種于另外一批裸鼠的肝左葉。接種5星期左右處死裸鼠，收集肝臟和肺臟，觀察肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況和肺轉(zhuǎn)移情況。檢測三組腫瘤Pyk2蛋白表達量的不同以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。同時取相應(yīng)腫瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測磷酸化狀態(tài)來比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化，確定這些變化與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，與Pyk2蛋白表達量的關(guān)系。4）蔗糖密度梯度超速離心定位和內(nèi)源免疫共沉淀取肝癌腫瘤的癌旁組織，裂解離心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速離心。取離心后的不同組分樣品做Western，分別用E-cadherin抗體和Pyk2抗體作為一抗檢測。如果二者表達最多的峰值是在同一個組分中，則提示我們二者在細胞內(nèi)是共定位的。取上述二者的表達較多的組分，用Pyk2單抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作對照），然后用E-cadherin單抗雜交檢測E-cadherin是否能與Pyk2共沉淀下來。相反方向則是：用E-cadherin單抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作對照），然后用Pyk2單抗雜交檢測Pyk2是否能與E-cadherin共沉淀下來。.技術(shù)路線（見下圖）定點突變，GST-pull down，免疫共沉淀等方法驗證確定相互作用的結(jié)構(gòu)域以及位點熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等方法驗證在細胞以及腫瘤組織中共定位收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料免疫組化、Western等方法檢測E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2表達量的相關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。磷酸化實驗確定E-cadherin是否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點細胞遷移實驗:測Pyk2蛋白過表達和RNAi抑制時與E-cadherin磷酸化水平、細胞遷移的關(guān)系。篩選穩(wěn)定表達Pyk2肝癌細胞株，檢測Pyk2蛋白表達量與E-cadherin磷酸化水平的關(guān)系。裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實驗:Pyk2蛋白表達量、E-cadherin磷酸化水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。匯總分析數(shù)據(jù)：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin機制；揭示Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。1. 左側(cè)部分：取E-cadherin與Pyk2不同結(jié)構(gòu)域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法確定二者相互作用的結(jié)構(gòu)域，以及作用位點。熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等方法驗證二者在細胞以及腫瘤組織中共定位；磷酸化實驗確定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點。這部分內(nèi)容從生化的角度確定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子機制。2. 中間部分：通過細胞遷移實驗、裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實驗從細胞水平、動物模型確定：Pyk2通過磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機制。3. 右側(cè)部分：收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料，通過免疫組化、Western等方法檢測E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化狀態(tài)，分析二者表達量的相關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4. 最下面部分為匯總數(shù)據(jù)，總結(jié)分析。4.可行性分析1） 前期實驗已經(jīng)從酵母雙雜交、GST-Pull Down、免疫共沉淀等證實了E-cadherin與Pyk2相互作用(見研究基礎(chǔ)部分)，而且二者功能上密切相關(guān)。E-cadherin作為一種細胞黏附分子在細胞黏附、細胞遷移和接觸抑制方面具有作用。而Pyk2能通過各種信號途徑參與調(diào)節(jié)細胞黏附、擴散和遷移等過程。因此，二者在功能上是有互相作用基礎(chǔ)的?？紤]到Pyk2是一個激酶蛋白，且前期實驗結(jié)果提示Pyk2激酶區(qū)域結(jié)合E-cadherin，因此有兩種可能，一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。根據(jù)文獻報道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其與Catenin、P120等形成復(fù)合體，從而影響細胞遷移。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)該就有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測，由于腫瘤始動因素的作用，Pyk2表達增多，活性增強，從而磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin降解，最終使細胞遷移性增強。我們上述實驗設(shè)計基本基于這個邏輯。磷酸化實驗證實Pyk2磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致E-cadherin蛋白減少。細胞遷移實驗和動物實驗設(shè)計邏輯是通過Pyk2過表達，檢測E-cadherin磷酸化增強，蛋白量減少，導(dǎo)致細胞遷移增強或者腫瘤轉(zhuǎn)移增加；RNAi抑制Pyk2的表達，則出現(xiàn)相反的結(jié)果，E-cadherin磷酸化減弱，蛋白量增加，導(dǎo)致細胞侵襲性減弱和腫瘤肺轉(zhuǎn)移減少。事實是否如此，需要實驗來證明。申請人以前的工作曾發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一個成員- Protocadherins能夠抑制Pyk2的活性，因此從邏輯上講也不能完全排除第二種可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是這樣的話，則可能的假設(shè)是：在正常細胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性，在腫瘤條件下，由于其他原因E-cadherin減少或消失，而不能抑制Pyk2活性，導(dǎo)致Pyk2活性增強，因而腫瘤細胞遷移性增強。如果基于這個邏輯的話，實驗設(shè)計就要改變?yōu)椋毫姿峄瘜嶒灂r應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為底物，觀察E-cadherin對Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后篩選E-cadherin過表達、功能失活突變體和空載體的穩(wěn)定表達肝癌細胞株，然后行細胞遷移實驗和裸鼠成瘤實驗，觀察E-cadherin蛋白過表達或功能失活突變后與細胞遷移或者腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時檢測其與Pyk2蛋白表達量及磷酸化水平相關(guān)性。但是申請人在完成- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做對比參照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明顯，因此這種可能性不大。從上面的分析來看，本課題在理論和邏輯上是可行的。2）本課題是本人前期工作的延續(xù)，本人對E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作構(gòu)建的質(zhì)粒表達載體等為本課題的下一步研究提供了很多有利的條件。本課題組的成員對所需要的技術(shù)方法都很熟練，且都有相應(yīng)的工作基礎(chǔ)，可以在各個方面進行協(xié)作。 3）本課題所涉及的技術(shù)均為較成熟的技術(shù)，所需的設(shè)備和條件本校都具備。（四）本課題的特色與創(chuàng)新之處1.本課題通過酵母雙雜交新發(fā)現(xiàn)一個與E-cadherin相互作用的蛋白-非受體型酪氨酸激酶Pyk2，并證明兩者的相互作用可靠，國內(nèi)外研究至今未曾見過報道，具有國際先進性和獨創(chuàng)性。（有報道二者的表達量與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，但是二者直接相互作用未見報道。）2. 本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2磷酸化E-cadherin影響肝癌細胞轉(zhuǎn)移的機制，對于E-cadherin在肝癌轉(zhuǎn)移過程中的分子機制有新的理解，因此具有獨創(chuàng)性和先進性。（五）年度研究計劃及預(yù)期研究結(jié)果1.年度研究計劃2011.01-2011.12 磷酸化實驗確定二者的調(diào)節(jié)關(guān)系，肝癌組織內(nèi)源免疫共沉淀確定相互作用可靠，同時確定二者結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，磷酸化位點。蔗糖密度梯度超速離心，熒光共定位等相關(guān)的實驗進一步確證二者共定位。同時收集病例標(biāo)本，收集臨床資料。純化蛋白制備抗體。2012.01-2012.12 細胞遷移實驗，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實驗檢測Pyk2的表達與E-cadherin的磷酸化狀態(tài)，以及細胞遷移的關(guān)系，確定其調(diào)節(jié)機制。同時完成E-cadherin/Pyk2的表達以及磷酸化狀態(tài)與肝癌的分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、復(fù)發(fā)等臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析。2013.01-2013.12 補充實驗遺漏，整理實驗資料，統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)，撰寫論文。2.預(yù)期研究結(jié)果1)確定Pyk2能夠磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的結(jié)構(gòu)域以及磷酸化位點。2)確定Pyk2通過磷酸化E-cadherin，從而影響肝癌細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。3)確定在肝癌組織中E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2表達量的相關(guān)性，以及二者的表達與肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。4)在國外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表SCI論文2-4篇，其中影響因子大于5的有一篇以上。在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文2-4篇，并在國內(nèi)外學(xué)術(shù)會議交流。5)培養(yǎng)研究生2-3名。二、研究基礎(chǔ)與工作條件（一） 研究基礎(chǔ)第一步：為了研究肝癌轉(zhuǎn)移的機制，首先選取E-cadherin（胞內(nèi)段，以下實驗同）為誘餌在肝臟的cDNA文庫中做酵母雙雜交，尋找與E-cadherin相互作用的蛋白。我們先選取的是LACZ系統(tǒng)藍白斑篩選，但是因為背景高而放棄。后來選取CytoTRAP系統(tǒng)，背景明顯減低，測序后有意義的基因有31個。其中有4個為Pyk2片段。通過克隆Pyk2基因全長驗證，確定二者在酵母中的相互作用是強陽性的（圖1）。（同時驗證Pyk2的同源蛋白FAK與E-cadherin相互作用為可疑弱陽性）。圖1 酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）驗證Pyk2與E-cadherin相互作用pMyr-Lamin為陰性對照，pMyr-SB為陽性對照，E-Cad為E-Cadherin縮寫，以下圖示與此相同。Psos-E-Cad為誘餌蛋白。CytoTRAP系統(tǒng)酵母雙雜交特點為兩個蛋白如果不相互作用在25時可以生長，而在37則不能生長,如陰性對照pMyr-Lamin所示。兩個蛋白如果相互作用則在兩個溫度下都能生長,如陽性對照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2與陽性對照相似。第二步：原核表達E-cadherin和His-Pyk2進行GST-Pulldown。為了驗證二者是直接結(jié)合，我們分別細菌中表達純化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全長非常難純化，得不到純化的蛋白。我們表達純化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown實驗結(jié)果證實Pyk2的激酶部分能夠與E-cadherin直接結(jié)合（圖2）。 泳道 1 2 3圖2 原核表達E-cadherin和His-Pyk2激酶部分進行GST-Pulldown。 分別原核表達GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分別與相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育，重復(fù)洗三次，用his抗體Western檢測，結(jié)果顯示His-Pyk2激酶部分能夠與GST-E-cadherin結(jié)合（泳道3），而不能與GST結(jié)合（泳道2），泳道1上圖是純化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。第三步：原核表達