造血干細胞研究進展.doc

.造血干細胞研究進展摘要：造血干細胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體,在人體造血系統(tǒng)中起著至關重要的作用。本文介紹了造血干細胞的生物學特征、表面標志以血干細胞在干細胞移植、細胞治療和基因治療等方面的臨床應用和前景。 造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)又稱多能干細胞,是存在于造血組織中的一群原始造血細胞。也可以說它是一切血細胞的原始細胞,即由造血干細胞定向分化、增殖為不同的血細胞系,并進一步生成血細胞。人類造血干細胞首先出現(xiàn)于胚齡第2 3周的卵黃囊,在胚胎早期(第2 3月)遷至肝、脾,第5個月又從肝、脾遷至骨髓。在胚胎末期一直到出生后,骨髓成為造血干細胞的主要來源。造血干細胞是干細胞中研究最早、最多、最深入的一種,近年來在造血干細胞的多個研究領域均取得了重要進展。1造血干細胞的發(fā)現(xiàn)造血干細胞的發(fā)現(xiàn)源于第二次世界大戰(zhàn)后放射醫(yī)學的研究， Jacobson 等1-3發(fā)現(xiàn)小鼠與豚鼠的脾臟與骨髓中存在有一類細胞，即造血干細胞，能夠重建經(jīng)致死劑量射線照射過的小鼠與豚鼠的造血系統(tǒng)。隨著單克隆抗體技術與流式細胞分選技術的出現(xiàn)，人們利用多種針對細胞表面抗原的抗體組合，分離到相對較純的小鼠與人骨髓與胚胎組織中的造血干細胞與造血前體細胞群(hematopoietic progenitorcell)。其中，美國斯坦福大學 Weissman 實驗室在分離與鑒定小鼠與人的造干細胞方面所做的工作最為杰出4-9。長期以來，對于造血干細胞是由多種不同的、可以分化成不同種類成熟細胞所組成，還是由一類可以分化成所有造血系統(tǒng)成熟細胞所組成，人們存有爭論。直到 1996 年，Osawa 等10通過單個細胞移植的方法，驗證了一個造血干細胞就可以重建機體整個的造血系統(tǒng)，才結束了對于這一問題的爭論。2對小鼠造血干細胞的早期發(fā)生的研究造血干細胞的發(fā)生到目前為止，人們對于小鼠造血干細胞的早期發(fā)生研究得相對較多。小鼠胚胎在完成原腸運動(gastrulation)后不久，一群中胚層的細胞就被 “ 決定 ”(determined)將要分化成造血細胞。小鼠胚胎中的多個組織，如卵黃囊(yolk sac)、主動脈 - 性腺 - 中腎(the aorta-gonadmesonephros region ，AGM) 、胎盤以及胚肝，都先后參與了造血細胞的發(fā)生16,17(圖 1)。最早的造血干細胞在第 7.5 天胚胎外的卵黃囊中出現(xiàn)18，這時候的造血干細胞主要分化成有核的紅細胞，這個時期的造血稱為 “ 原始造血 ”( p r i m i t i v ehematopoiesis)。對 BMP-4 基因敲除小鼠的研究顯示，BMP(bone morphogenetic protein)信號通路參與了原始造血的過程19。原始造血只短暫存在于小鼠胚胎的第 7 至 11 天，主要的功能是為快速生長的胚胎提供氧氣供應，隨后即迅速消失。在胚胎的第8.5 天，AGM 區(qū)域出現(xiàn)第二波造血干細胞20,21，這時候胚胎內部的血液循環(huán)開始建立，這個階段的造血稱為 “ 永久造血 ”(definitive hematopoiesis)。永久造血產(chǎn)生的造血干細胞可以分化成造血與免疫系統(tǒng)的所有終端分化細胞，其造血干細胞的功能可以一直延續(xù)到成年以后。在小鼠第 10 天的胚胎中，造血干細胞開始向肝臟遷移，到胚胎第 12.5 天時，胚肝成為胚胎最主要的造血器官。在胚胎期的第16天時，胚肝的造血干細胞開始向骨髓中遷移6，這種遷移一直持續(xù)到出生后。最終，骨髓成為成體動物最主要的造血器官。關于發(fā)生在卵黃囊的 “ 原始造血 ” 與發(fā)生在AGM 區(qū)域的 “ 永久造血 ”，究竟具有共同的還是相對獨立的起源，目前依然存有爭論。3造血干細胞的生物學特征造血干細胞是體內各種血細胞的唯一來源,存在于骨髓、臍血和外周血中,具有自我更新或自我維持能力、高度增殖潛能、多向分化潛能。3.1自我更新或自我維持能力正常情況下,HSC經(jīng)過不對稱性有絲分裂形成兩個子代細胞。其中一個仍維持造血干細胞的全部特征,即自我更新(self- renewal)。自我更新使得干細胞池的大小(干細胞數(shù)量)和質量維持不變,因而又稱為自我維持(self- maintenance)。另一個子細胞在有絲分裂過程中特征發(fā)生改變逐漸走向分化的途徑,成為不同譜系的祖細胞、前體細胞和成熟的血細胞,替代消耗或者衰老的細胞,從而維持循環(huán)的各種血細胞的數(shù)量。3.2高度增殖潛能在骨髓中,HSC約占骨髓細胞的0.05%,且大多數(shù)處于G0期。正常生理情況下,僅需不足10%的HSC處于增殖狀態(tài)就足以維持機體恒定造血1。放、化療造成造血細胞群明顯耗竭或在某些細胞因子和HSC動員劑等因素作用下,HSC能大量地分裂,從而有更多的HSC進入細胞周期。3.3多向分化潛能HSC不僅可分化為各系統(tǒng)的血細胞系,如紅細胞系、粒細胞系、單核-吞噬細胞系、巨核細胞系以及淋巴細胞系,還具有可塑性,可向某些非造血細胞轉化2,如神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、肝臟細胞、血管內皮細胞以及多種組織的上皮細胞等。4、造血干細胞的生物學特征造血干細胞(HematopoietieStemCell,HSC)是一小群具有高度的自我復制和多向分化潛能的最原始的造血細胞。它具有2個重要的特征:l)高度的自我更新或自我復制能力;2)可分化生成所有類型的血細胞。在發(fā)育生物學上,造血干細胞屬于成體干細胞的一種。又因其可分化出至少12種血細胞,所以造血干細胞是一種多能的干細胞。正常情況下,造血干細胞經(jīng)過不對稱性有絲分裂形成兩個子代細胞。其中一個仍維持造血干細胞的全部特征,即自我更新(sel-fernewal)。自我更新使得干細胞池的大小(干細胞數(shù)量)和質量維持不變,因而又稱為自我維持(sel-fmiantenance)。另一個子細胞可能由于基因表達模式發(fā)生改變而使得細胞特征出現(xiàn)變化,從而逐步走上分化的道路?，F(xiàn)已知道,造血干細胞不是純一的細胞群體,而是由不同年齡等級的干細胞組成。這些不同年齡等級的干細胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表達不一,生物學特性也有一定的差異。5造血干細胞的表面標志HSC存在著不同發(fā)育階段、數(shù)量極少、體積較小、比重較輕、形態(tài)相似,沒有特異的形態(tài)學特征,至今仍不能單從形態(tài)學上來識別。因此要對HSC進行研究,首先必須能把它從造血組織中分離出來。最常用的方法就是利用HSC表面的標志蛋白對其進行分離。5.1CD34抗原CD34分子為105 120kD的高度糖基化的I型跨膜糖蛋白,選擇性表達于早期造血干/祖細胞、小血管內皮細胞及胚胎成纖維細胞表面,可能具有細胞間粘附、阻遏造血細胞分化等功能,隨著細胞分化成熟逐漸減少甚至消失。CD34+造血干細胞是一組異質性細胞群體,可進一步分化為CD34+ CD38-和CD34+ CD38+兩個亞群。CD34+細胞群中90%為祖細胞,極少為HSC。最近研究表明,絕大多數(shù)CD34+細胞同時表達CDCP1,分離純化的CDCP1細胞可使NOD/SCID小鼠重建造血,提示CDCP1是一種新的造血干細胞表面抗原標志3。近年應用Ly5抗原等位基因不同的大鼠品系進行競爭性長期重建(competitive long term recon-sititution,CLTR)分析,發(fā)現(xiàn)大鼠體內存在有CD34-的HSC群,并可分化為CD34+的HSC4,同時在人、豚鼠和恒河猴骨髓細胞以及人臍血中亦發(fā)現(xiàn)具有長期重建造血能力的CD34-細胞,并且在長期培養(yǎng)后可形成集落,伴隨集落的形成亦由CD34-轉變?yōu)镃D34+,可見,CD34+造血細胞起源于CD34-。CD34表面標志從無到有,又從有到無,充分顯示了造血干/祖細胞產(chǎn)生、發(fā)育、分化和成熟的全過程。5.2胸腺抗原- 1(Thy- 1,CD90)Thy- 1抗原作為造血干細胞比CD34分子出現(xiàn)得早,Thy- 1是細胞表面I型糖蛋白連接分子,表達在早期造血細胞表面,與細胞間粘附有關,介導負增殖信號,抑制細胞的增殖分化5。CD34+ Thy- 1+細胞約占CD34+細胞群的0.1% 0.5%,是具有高度自我更新能力和多項分化潛能的造血干細胞。因Thy- 1+是造血干細胞表面的早期標志,故可利用其為標志進行造血干細胞的篩選6。5.3血管內皮生長因子受體- 2(vascular endo-thelial growth factor receptor- 2, VEGFR- 2,又稱KDR)Ziegler7提出KDR是鑒定干細胞的標志,并可由此鑒別干細胞和祖細胞。用RT- PCR證實,在人出生后的造血組織中,0.1% 0.5%的CD34+細胞表達KDR,多能造血干細胞只存在于CD34+KDR+細胞部分,而CD34+ KDR-細胞亞群則主要包括一些系特異的定向祖細胞。用有限稀釋法分析接受異種骨髓移植小鼠CD34+ KDR+細胞中的HSC的比例結果證實,在骨髓中,HSC的比例為20%,經(jīng)12周長期培養(yǎng)(LTC)分析,骨髓、外周血和臍血中HSC可達25% 42%,如在長期培養(yǎng)過程中添加VEGF,HSC的比例可增至53% 63%。因此,KDR是一個可用于定義造血干細胞,并使其區(qū)別于造血祖細胞的陽性功能性標志。5.4干細胞因子受體(SCFR,又稱c- kit,CD117)CD117可編碼一種穿膜酪氨酸激酶受體分子,應用單克隆抗體證明此分子可存在于造血干細胞膜上,約60% 75%的CD34+造血干細胞同時表達CD117。其配體- -干細胞因子(stem cell factor,SCF)在造血干細胞的生存和增殖分化中起著重要作用,研究發(fā)現(xiàn)CD34+ CD117+比CD34+ CD117-細胞具有更高的集落形成能力。CD117也存在于肥大細胞和急性髓樣白血病細胞表面。5.5AC133抗原AC133是更早期造血祖細胞和造血干細胞的特異性標記。它是一相對分子質量為120kD的糖蛋白,可與一種新的雜交瘤細胞系所產(chǎn)生的抗干細胞糖蛋白抗原的單克隆IgG抗體特異性結合。AC133選擇性地表達于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖細胞表面。與CD34抗原表達不同的是,AC133抗原不表達在人臍靜脈血管內皮細胞、KGla細胞(AML細胞系)或纖維母細胞上,同時,AC133+細胞群含有比CD34+細胞群更多的早期造血細胞,再植效率更高,而且與白血病和內皮細胞關系密切8,9。6造血干細胞的可塑性(Plastieiyt)造血干細胞的可塑性是指除可以分化為各系血細胞外,還可以分化為多種非造血組織的細胞,如神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、肝臟細胞、血管內皮細胞以及多種組織的上皮細胞等。目前對造血干細胞多向分化的機制仍不清楚,對這一機制的探討以及對造血干細胞定向分化的調控將大大擴展其在臨床上的應用。因為這不僅可以繞過用人的胚胎干細胞作為移植治療的細胞來源,而且可以減輕異基因移植帶來的免疫排斥問題。7造血干細胞的臨床應用造血干細胞正廣泛應用于一些疾病的治療,并取得了可觀的療效,成為干細胞研究和應用的成功范例。7.1細胞治療細胞治療,即給患者輸注治療細胞,通過這些細胞在體內發(fā)揮功能以達到治病的目的,如抗腫瘤等。目前已建立了體外誘導擴增樹突狀細胞(DC)的方法,可以從臍帶血或自體的外周血干細胞誘導擴增出大量的DC,進一步使其裝載腫瘤特異性抗原后,誘導抗原特異性CTL殺傷腫瘤細胞。DC回輸療法已成功地試用于非何杰金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤晚期患者的治療。7.2基因治療基因治療是指將外源基因或核酸導入人體防治疾病的一種技術和治療方法。為了使帶有目的基因的細胞在病人體內長期或永久地表達,必須選一種能在體內自我更新和自我維持的永不消亡的細胞作為宿主細胞。造血干細胞因其能自我更新、多向分化,在體內常態(tài)造血過程中永不耗竭,同時在分化過程中能保持基因組DNA的相對穩(wěn)定,從而成為某些疾病基因治療的一種理想靶細胞。利用造血干細胞作為基因治療的靶細胞其優(yōu)勢在于:(1)取材容易,來源于患者自體或臍帶血;(2)自我更新能力強,有利于基因長期、穩(wěn)定的表達;(3)造血干細胞具有向各系分化的能力,由其分化而成的細胞便可隨血液循環(huán)分布到身體各處,利于其所揭?guī)У耐庠椿蚋笙薅鹊匕l(fā)揮治療作用;(4)造血干細胞無論在骨髓內還是在循環(huán)血中,目的基因產(chǎn)物都能通過血循環(huán)而到達靶器官14。近年來,隨著造血干細胞采集、分離純化、體外培養(yǎng)、擴增、以及移植等技術日趨成熟,使造血干細胞在基因治療中的應用得到了技術保證。但由于造血干細胞僅占骨髓細胞的0. 001%,故培養(yǎng)和分離純化不易。運用造血干細胞做基因治療的研究,目前面臨的最大困難是人類造血干細胞的基因導入率非常低。這主要是因為人的造血干細胞表面缺乏裝載治療基因的重組逆轉錄病毒載體的受體,而且,人的造血干細胞大部分處于G0靜止期,用重組逆轉錄病毒載體裝載的治療基因很難整合到靜止期的細胞染色體基因組中去。現(xiàn)在,國內外不少先進的實驗室正對此進行深入研究。一旦這些難題得到了解決,造血干細胞移植治療的適應癥可以大大擴展;腫瘤的治療也會出現(xiàn)一個新的紀元。7.3 造血干細胞移植造血干細胞移植技術已經(jīng)逐漸成熟并且得到廣泛的應用,已經(jīng)成為治愈惡性血液病和實體瘤等疾病的可靠選擇,成為干細胞研究和應用的成功范例。大量基礎和臨床研究表明,經(jīng)動員的外周血中CD細胞數(shù)量是骨髓中的2倍,因此目前用的細胞因子動員的外周血干細胞移植已取代了最初采用的骨髓來源干細胞的移植。這不僅因為從外周血收集細胞比骨髓中收集更容易,痛苦小、無需麻醉,不需留院便能采集到更好的細胞,而且外周血于細胞移植具有重建造血功能快、免疫功能恢復早、存活率更高、并發(fā)癥輕等骨髓干細胞移植所不具備的幾個顯著優(yōu)點。造血干細胞移植后骨髓功能的全面重建主要包括2個方面,即骨髓細胞數(shù)量和細胞功能的恢復及細胞之間相互作用功能的完善,后者主要指免疫功能。外周血干細胞更容易歸巢可能是外周血移植時造血和免疫重建比骨髓移植快的原因之一。臍帶血因其免疫抗原性較弱的特點,被認為是極具潛力的自骨髓來源和外周血來源后,第3種造血干細胞移植的來源。而每份臍血的含量僅在lxlO7左右,因此目前一般只用于兒童。有了造血干細胞移植的支持,臨床醫(yī)生就可以使用超大劑量的放療、化療,最大限度地清除患者體內的癌細胞,然后植人造血干細胞重建被破壞的造血和免疫系統(tǒng)。隨著臨床和基礎研究的發(fā)展,為其他器官的移植奠定基礎,又是造血干細胞移植作為支持治療的另一個方面。異基因造血干細胞移植后,可在受者體內誘導形成供者一受者嵌合體,使受者產(chǎn)生對供者特異的、終生的耐受。這樣,再進行組織或器官移植,就可以降低免疫排斥發(fā)生的強度.從而提高移植物的存活率。通報20()6年第41卷第2期此外,通過對自體造血干細胞進行遺傳修飾后,使其缺陷基因的功能得到補充,也可以用于再生障礙性貧血、p地中海貧血等骨髓造血功能衰竭和某些先天遺傳性疾病或代謝系統(tǒng)疾病的移植治療,而且繞過了免疫排斥的問題。通過基因修飾,還可以賦予干細胞及其子代細胞新的特性,如轉入多藥耐藥基因MDR可使其抵抗化療帶來的清髓效應;導入某種基因使其可抵抗HW的感染等。7.4造血干細胞與白血病干細胞近年來，隨著癌癥干細胞(cancer stem cell)理論的升溫，以及在多種腫瘤組織中陸續(xù)分離到具有“自我更新”與“定向分化”能力的癌癥干細胞，使得人們對癌癥干細胞的起源，以及組織干細胞與癌癥干細胞相互關系的研究日益深入。Dick 實驗室通過將 AML 白血病患者的不同的細胞群移植入免疫缺陷的 SCID 小鼠模型，發(fā)現(xiàn) CD34+CD38- 細胞群能夠在小鼠中引發(fā) AML 白血病，而 CD34+CD38+與 CD34- 細胞群則無法引發(fā)白血病，顯示白血病干細胞可能存在于 CD34+ CD38- 細胞群中108。之后，Dick 實驗室又證明白血病干細胞起源于正常的造血干細胞，而不是造血前體細胞109。然而， Armstrong實驗室利用 MLL-AF9 白血病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)造血前體細胞可以經(jīng)突變后轉變成白血病干細胞110。目前的觀點認為，白血病干細胞既可以由正常的造血干細胞經(jīng)過基因突變喪失對其自我更新功能的負向調控而產(chǎn)生，也可能由正常的造血前體細胞或終端分化細胞經(jīng)過基因突變重新獲得了“自我更新”能力而得來(圖 4)。如果尋找到能夠特異性殺傷癌癥干細胞的藥物或治療手段，將極大地提高癌癥治療的效果。如前所述，癌癥干細胞具備許多與正常組織干細胞相似的特性，因此人們擔心在使用藥物對癌癥干細胞進行殺傷的同時，可能也會對正常的組織干細胞造成傷害。然而 Morrison 實驗室的一項研究表明，白血病干細胞與正常的造血干細胞對藥物會有不同的反應，能夠實現(xiàn)在不損傷正常造血干細胞的前提下，對白血病干細胞實施有效地殺傷44。因此，鑒定不同組織來源的癌癥干細胞與正常組織干細胞在代謝途徑上差異，然后篩選或設計特異性藥物殺傷癌癥干細胞，將是今后癌癥干細胞研究的一個重要方向。8挑戰(zhàn)與展望盡管造血干細胞已經(jīng)成功地運用于臨床疾病的治療，但是目前造血干細胞的研究依然面臨著許多挑戰(zhàn)。首先，與胚胎干細胞以及其他種類的組織干細胞(如神經(jīng)干細胞)不同，造血干細胞目前尚無法實現(xiàn)在體外的長期培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，造血干細胞更傾向于分化而非自我更新。目前臍帶造血干細胞移植很少用于成人白血病的治療，其主要原因就是臍帶血中的造血干細胞數(shù)量太少，無法滿足成人治療所需。因此，研究細胞內因子與微環(huán)境信號對維持造血干細胞自我更新的作用機制，對于最終實現(xiàn)造血干細胞在體外的