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分類號: 單位代碼: 10389 密 級: 學 號: 1091515 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 尖孢鐮刀菌致病性分化及其 枯萎病植物疫苗工程菌 建 學 科 門 類:理學 一級學科名稱:生物學 二級學科名稱:微生物學 研 究 方 向:應用微生物學與基因工程 研 究 生: 指 導 教 師: 完 成 時 間:二 O 一三年四月 on 2013 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明,所呈交的學位(畢業(yè))論文,是本人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果,并且是自己撰寫的。盡我所知,除了 文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外,論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻的同志,都在論文中作了明確的說明并表示了謝意,如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權的行為,由本人承擔應有的責任。 學位(畢業(yè))論文作者親筆簽名: 日期: 論文使用授權的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學有關保留、使用學位(畢業(yè))論文的規(guī)定,即學校有權送交論文的復印件,允許論文被查閱和借閱 ; 學??梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热?,可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密,在 年后解密可適用本授權書。 不保密,本論文屬于不保密。 學位(畢業(yè))論文作者親筆簽名: 日期: 指導教師親筆簽名: 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 i 目 錄 中文摘要 . I . 一章 緒論 . 1 1 非致病性尖孢鐮刀菌的研究進展 . 1 非致病性尖孢鐮刀菌的生防機制 . 1 非致病性尖孢鐮刀菌的篩選 . 1 從自然界中篩選非致病性尖孢鐮刀菌 . 1 人工突變獲得非致病性尖孢鐮刀菌 . 2 非致病性尖孢鐮刀菌與其他微生物結合使用 . 3 非致病性尖孢鐮刀菌的應用 . 4 2 子標記技術及其應用 . 4 3 脂肪酸圖譜分析技術及其應用 . 5 4 本研究的目的及意義 . 6 第二章 枯萎病植物疫苗工程菌 物學特性研究 . 7 引言 . 7 1 材料和方法 . 7 材料 . 7 方法 . 7 培養(yǎng)時間對植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 株生長的影響 . 7 營養(yǎng)條件對植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 株生長的影響 . 7 植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 長的影響 . 8 溫度對植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 長的影響 . 8 葡萄糖標準曲線的制作 . 8 2 結果與分析 . 8 培養(yǎng)時間對植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 株的生長影響 . 8 菌株培養(yǎng)過程中菌絲干重的變化 . 8 菌株培養(yǎng)過程中產(chǎn)孢量的變化 . 9 菌株培養(yǎng)過程中 變化 . 9 菌株培養(yǎng)過程中發(fā)酵液還原糖的變化 . 10 營養(yǎng)條件對植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 長的影響 . 11 碳源對菌株生長速率的影響 . 11 碳源對菌株產(chǎn)孢量的影響 . 12 碳源對菌落形態(tài)的影響 . 12 氮源對菌株生長速率的影響 . 13 氮源對菌株產(chǎn)孢量的影響 . 14 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 氮源對菌落形態(tài)的影響 . 15 植物疫苗工程菌尖孢鐮刀菌 株生長的影響 . 16 菌株生長速率的影響 . 16 菌株產(chǎn)孢量的影響 . 17 溫度對植物疫苗工程菌尖孢鐮 刀菌 株的生長的影響 . 18 度對菌株生長速率的影響 . 18 度對菌株產(chǎn)孢量的影響 . 19 3 討論 . 19 第三章 尖孢鐮刀菌遺傳多樣性 析 . 22 引言 . 22 1 材料與方法 . 22 材料 . 22 方法 . 24 菌絲的培養(yǎng)及 提取 . 24 ( 6) 20 保存待用。 . 24 度的測定 . 24 菌株的鑒定 . 24 引物的篩選 . 24 電泳譜帶的記錄及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 . 25 2 結果與分析 . 25 菌株的鑒定 . 25 物篩選與擴增結果 . 26 供試尖孢鐮刀菌聚類結果分析和遺傳相似性分析 . 29 3 討論 . 30 第四章 尖孢鐮刀菌的脂肪酸生態(tài)學 . 31 引言 . 31 1 材料與方法 . 31 材料 . 31 方法 . 31 脂肪酸的提取方法 . 31 脂肪酸的檢測 . 32 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記測定 . 32 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記聚類分析 . 32 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記的主成分分析 . 32 尖孢鐮刀菌聚類分析 . 32 2 結果與分析 . 33 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記測定 . 33 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記聚類分析 . 34 尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記的主成分分析 . 35 尖孢鐮刀菌聚類分析 . 36 3 討論 . 37 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 五章 枯萎病植物疫苗工程菌 生防效果 . 39 引言 . 39 1 材料與方法 . 39 材料 . 39 方法 . 39 枯萎病植物疫苗工程菌 西瓜盆栽苗枯萎病防效的測定 . 39 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗枯萎病防效的測定 . 40 2 結果與分析 . 40 枯萎病植物疫苗工程菌 西瓜盆栽苗枯萎病防效的測定 . 40 枯萎病植物疫苗工程菌 香 蕉盆栽苗枯萎病防效的測定 . 41 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗生長特性的影響 . 41 枯萎病植物疫苗工程菌 香蕉盆栽苗枯萎病防效的測定 . 42 3 討論 . 43 結論與展望 . 45 參考文獻 . 47 致謝 . 53 個人簡歷 . 54 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 I 中文摘要 本文比較研究了含無毒基因的非致病性植物疫苗工程菌 致病性尖孢鐮刀菌 之間生物學差異,利用 子標記技術明確非致病性尖孢鐮刀菌致病性菌株之間的遺傳差異性和親緣關系,探討非致病性菌株與致病性菌 株之間脂肪酸組成和含量的相關性,以及該菌株對西瓜和香蕉的生防效果。 研究不同時間段、不同營養(yǎng)條件、不同培養(yǎng)條件下的菌株的生長特性,結果表明:在培養(yǎng)過程中菌株 產(chǎn)孢量處于 106 106 間,總體低于菌株 絲干重處于 0000間,高于菌株 株 發(fā)酵液中還原糖的含量逐漸減少,從 mg/至 3.3 mg/株化不明顯;淀粉 利于菌株 絲生長,葡萄糖利于其產(chǎn)孢;木糖不利于菌株 絲的生長,果糖利于其產(chǎn)孢。有機氮為氮源菌絲生長速率快,銨鹽既不利于菌絲的生長,也不利于產(chǎn)孢。碳源對菌落形態(tài)的影響不大,氮源對菌落形態(tài)的影響比碳源大。 時菌株的生長速率最快, 時菌株的產(chǎn)孢量最大。 25 時菌株的生長速率最快, 30 時菌株的產(chǎn)孢量最大。 采用 子標記技術對 46 株尖孢鐮刀菌進行分析, 15 條引物共擴增出 165 個條帶,多態(tài)率條帶數(shù)為 163 條,多態(tài)率為 通過聚類分析圖對尖孢鐮刀菌遺傳多 態(tài)性進行研究表明在 水平上,供試的 46 株尖孢鐮刀菌明顯分為 3 個 群。 記技術在鐮刀菌種內都表現(xiàn)出明顯的遺傳差異性,非致病性尖孢鐮刀菌 不含無毒基因的尖孢鐮刀菌之間的遺傳差異性較大、同源性較低、親緣關系較遠。 利用氣相色譜技術 對 46 株尖孢鐮刀菌菌株細胞內的脂肪酸,分析不同尖孢鐮刀菌脂肪酸生物標記的結構組成和分布特點。對 46 株尖孢鐮刀菌的脂肪酸進行聚類分析,可以聚成 2 類,即類群 、類群 ;類群 分為 2 個亞類群,即亞類群 ,亞類群 ,亞類群 為非致病性菌株。表明尖孢 鐮刀菌脂肪酸的結構組成和分布特性與菌株的致病性具有一定的相關性。 采用 6 種不同的處理方式,先接入非致病性尖孢鐮刀菌發(fā)酵液, 7 d 后再接入致病菌的方式,生物防治效果最好。非致病性尖孢鐮刀菌 香蕉盆栽苗有促長得作用,顯著增加株高和葉片數(shù),防效為 75%;對西瓜枯萎病盆栽苗的防效為 關鍵詞 :非致病性尖孢鐮刀菌;生物學;遺傳多樣性;脂肪酸;生防效果 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 he of to is . vr . To of . . of of . . . of In on of as of of is 106 106 mL is 0000mL of in of mg/mL .3 mg/is to of of is to is to of of is to is of is to of to a on pH , pH . 5 , 0 . 6 A 65 5 in . of . 6 . . . 6 . by of is to in . to , ; , , to of of . . is . 7 d of in of by . of 建農(nóng)林大學碩士學位論文 in by 5 %. by 5 %. of of . 建農(nóng)林大學碩士學位論文 1 第一章 緒論 1 非致病性尖孢鐮刀菌的研究進展 尖孢鐮刀菌是一種常見的土傳性真菌,廣泛存在于世界各地各種類型的土壤中。具有菌株的多樣性,所有這些都是成功的腐生菌,即能夠長期生存于土壤的有機質中和許多植物的根際。有些菌株即非致病性尖孢鐮刀菌能夠寄生在植株中但不致病 ,也就是說 ,在某種程度上菌株能侵入植物組織卻不誘導發(fā)病;有些是致病性的菌株,造成植株根腐或維管束病變。尖孢鐮刀菌存在多種?;途哂泻軓姷募闹魈禺愋裕鶕?jù)寄主植株的種類和品種,可以分為多種?;秃蜕硇》N。尖孢鐮刀菌造成植物的萎蔫,嚴重損害重要的經(jīng)濟作 物。 非致病性尖孢鐮刀菌在土壤微生物生態(tài)方面起著重要的作用,特別是抑制由致病菌引起的發(fā)病。非致病性尖孢鐮刀菌具有重要作用的第一個證據(jù)是土壤中含有大量的非致病性尖孢鐮刀菌能夠抑制枯萎病。世界不同地區(qū)的一些研究都清楚地表明非致病性鐮刀菌可以抑制鐮刀菌枯萎病非致病性尖孢鐮刀菌 被研究得最多的菌株,該菌由是法 究中心 士研究篩選、并已成功應用的生防菌,可以有效防治由尖鐮孢菌引起的多種植物枯萎病。到目前為止,非致病性的生防機制是通過比較土傳性致病菌株與非致病性菌進行的 研究。 非致病性尖孢鐮刀菌的生防機制 關于非致病性尖孢鐮刀菌的作用機制主要包括 3 種:競爭營養(yǎng)成分,競爭感染部位和定植部位,誘導系統(tǒng)抗性。 現(xiàn)非致病性尖孢鐮刀菌防治鐮刀菌枯萎病的效果與它們競爭碳源的能力有關( 1990)。體外無土栽培時,致病菌 F. f. 生防菌 爭的主要營養(yǎng)成份是碳源( 1991)。對枯萎病的控制不 是依靠接入很高濃度的非致病菌,而是要求非致病菌的數(shù)量遠多于致病菌。 為非致病的鐮刀菌減少芹菜枯萎病發(fā)病與根表面侵染位點的競爭有關( 1984)。 過測定病原菌或生防菌侵入后在根部定殖的相對數(shù)量證實了這一結論( 1991)。所謂誘導系統(tǒng)抗性即植物在遭受一些生物或非生物的壓力時所做出的系統(tǒng)防御反應,非致病性尖孢鐮刀菌作用于植物后,植物受到誘導,與抗病相關的酶活性顯著增強,并且植物體中會產(chǎn)生植保素等物質。 為在番茄中非致病菌 作用機理為誘導系統(tǒng)抗性,與幾丁質酶, 3 葡聚糖酶和 , 4 葡糖苷酶活性有關( et 1997)。 非致病性尖孢鐮刀菌的篩選 從自然界中篩選非致病性尖孢鐮刀菌 由于非致病性尖孢鐮刀菌在防治植物枯萎病方面有著自身的優(yōu)勢,所以擴大篩選機制以獲得更多的非致病性菌株,提高現(xiàn)有菌株的生防效果極為重要。非致病性尖孢鐮刀福建農(nóng)林大學碩士學位論文 2 菌存在于土壤或者寄生于植物組織,所以其分離主要分為兩個方面:從土壤中分離或者從植物中分離。 20 世紀 70 年代初首次在拮抗性土壤中發(fā)現(xiàn)了非致病性 鐮刀菌,并且發(fā)現(xiàn)在對鐮刀菌枯萎病有拮抗作用的土壤中,存在

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