【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制預(yù)防獸醫(yī)學(xué)論文

I 密級(jí) : 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 O 型口蹄疫病毒多基因 苗的研制 NA NA 英文縮略詞 縮略詞 英文名稱 中文名稱 突狀細(xì)胞 芐青霉素 鼠腎細(xì)胞系 細(xì)胞介素 瘤壞死因子 二烷基磺酸鈉 -4,52,5甲基偶氮唑鹽 二胺四乙 酸 s 限必需培養(yǎng)基 牛血清 . 油酰磷脂酰乙醇胺 物血凝素 刀豆蛋白 A 糖體進(jìn)入位點(diǎn) 光霉素 B 培養(yǎng)基 N甲基氨基乙烯氨甲酰膽固醇 密度 單室脂質(zhì)體 單室脂質(zhì)體 室脂質(zhì)體 酸緩沖鹽水 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 0% 數(shù)組織培養(yǎng)感染量 分鐘 轉(zhuǎn)速 原遞呈細(xì)胞 氨酸甘氨酸天門(mén)冬氨酸 擾素 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 轉(zhuǎn)錄 苯二胺 要組織相容性復(fù)合體 0% 數(shù)感染量 細(xì)胞病毒 胞毒性 T 細(xì)胞 使 克隆位點(diǎn) 瘤病毒 純皰疹病毒 生長(zhǎng)激素 數(shù)致死量 細(xì)胞受體 肝病毒表明抗原 類免疫缺陷病毒 根過(guò)氧化物 酶 免疫球蛋白 G 粒白細(xì)胞 原加工轉(zhuǎn)運(yùn)體 疫刺激復(fù)合物 病毒 0 猴空泡病毒 ot 休克蛋白 酸激酶 鏈延伸因子 乙烯亞胺 多糖 of 化群 助性 T 細(xì)胞 O 型口蹄疫病毒多基因 苗的研制 摘 要 研制帶有 O 型口蹄疫病毒（ 結(jié)構(gòu)蛋白基因及多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白基因的 苗，本研究通過(guò)定點(diǎn)突變方法和 增方法，獲得包含有結(jié)構(gòu)蛋白 結(jié)構(gòu)蛋白 2A、 3C 以及部分 2B、 3B 編碼基因的片段 包含有 結(jié)構(gòu)蛋白 結(jié)構(gòu)蛋白 2A、 3C、 3D 以及部分 2B、 3B 編碼基因的片段獲得的基因片段直接 /酶切后與同樣處理的真核表達(dá)質(zhì)粒連接 ,12 1212重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定、分析，并將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 胞，通過(guò)雙抗體夾心 法和間接免疫熒光標(biāo)記方法檢測(cè)細(xì)胞中 原的表達(dá)，用電子顯微鏡觀察病毒空衣殼的組裝；為評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒作為 苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及本動(dòng)物的免疫效果，將重組質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射方法接種豚鼠，并與酵母表達(dá)的純化 3D 蛋白及帶有牛干擾素（ 的真核表達(dá)質(zhì)粒 別 /同時(shí)免疫，第二次免疫后第三周豚鼠攻以 100 1000 O 型 ；1212帶有牛干擾素（ 的真核表達(dá)質(zhì)粒 周后經(jīng)牛舌皮攻以 104 型 。結(jié)果表明： 1) 因片段正確克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒載體上， 因和 042 4452別編碼 1 014 和 1 484 個(gè)氨基酸。與親本毒株 相應(yīng)編碼序列比較，同源性分別為 2）重組質(zhì)粒均可在 胞中表達(dá) 的蛋白；帶有內(nèi)含子的質(zhì)粒 1212 12 1，且其表達(dá)的蛋白能正確組裝成病毒空衣殼。 3）質(zhì)粒 12獨(dú)免疫豚鼠后第 2 周誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異抗體和中和抗體以及較強(qiáng)的 T 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，攻毒后豚鼠獲得完全保護(hù)。但與 3D 蛋白共同免疫后，抗體水平?jīng)]有明顯提高，攻毒后的保 護(hù)率也明顯低于質(zhì)粒 12獨(dú)免疫組。 4）質(zhì)粒 組質(zhì)粒共免疫的豚鼠特異性抗體水平在第一次免疫后出現(xiàn)，并在第二次免疫后的第一周進(jìn)一步提高；各免疫組的脾臟 T 淋巴細(xì)胞均在第一次免疫后出現(xiàn)增殖反應(yīng) ,并在第二次免疫后進(jìn)一步增強(qiáng)；質(zhì)粒 12 免組的保護(hù)率為 25。 5）所有牛在免疫后均出現(xiàn)特異抗體； T 淋巴細(xì)胞在免疫后明顯增殖；攻毒后免疫牛發(fā)病遲緩、病變程度較輕。 這些真核表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建為口蹄疫基因免疫的研 究提供了基礎(chǔ)，并為從分子水平上防制辟了新的途徑。 關(guān)鍵詞 ： 苗 , 基因免疫，豚鼠，牛 y of CR we 121, 2A, 3C a B B 121, 2A, 3C， 3D a B B. by V 12+) by by by of by by In to of to 1212D or FN of to or TT by 1) 12121212042nt 452nt of to 2) 121212 3) by 12in In 12D 12 4) by 121212in in In 12FN 5) of In of a of NA ey 錄 第一章 序 言 . 1 究背景 . 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 2 蹄疫基因疫苗的構(gòu)成 . 2 蹄疫基因疫苗的免疫機(jī)理 . 3 蹄疫基 因疫苗的不同免疫形式 . 4 疫佐劑在口蹄疫基因疫苗研究中的應(yīng)用 . 6 究目的及意義 . 8 第二章 口蹄疫病毒 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 . 10 料與方法 . 11 株與質(zhì)粒 . 11 要試劑 . 11 要儀器 . 11 因 (片段 )的 增 . 11 因 (片段 )的 增 . 12 12因（片段）的 增 . 12 因的 增 . 12 3D 基因的 增 . 14 12因的 增 . 14 組質(zhì)粒的構(gòu)建、克隆及檢測(cè) . 14 果 . 17 段、片段和片段的擴(kuò)增及鑒定 . 17 123D、 因片段的擴(kuò)增及鑒定 . 17 隆及鑒定 . 17 因的序列測(cè)定及分析 . 19 論 . 19 第三章 口蹄疫病毒多基因重組質(zhì)粒在 胞中的表達(dá) . 21 料與方法 . 21 要材料 . 21 組質(zhì)粒的純化回收 . 22 胞的轉(zhuǎn)染 . 22 接免疫熒光檢測(cè) . 22 抗體夾心 測(cè) . 22 毒空衣殼的電鏡觀察 . 22 果 . 22 心 檢測(cè)結(jié)果 . 22 接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 . 24 蹄疫病毒空衣殼的電鏡觀察 . 25 論 . 25 第四章 口蹄疫裸基因疫苗對(duì)豚鼠的免疫效果研究 . 28 料與方法 . 28 粒、病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 28 要試劑 . 29 粒大量提取 . 29 驗(yàn)動(dòng)物免疫 . 29 異抗體的檢測(cè) . 30 清中和抗體的檢測(cè) . 30 鼠 T 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) . 30 毒試驗(yàn) . 31 果 . 31 異抗體水平的動(dòng) 態(tài)變化 . 31 清中和抗體水平 . 31 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) . 33 毒試驗(yàn) . 33 論 . 33 第五章 口蹄疫基因疫苗多質(zhì)粒混合免疫方式對(duì)豚鼠的免疫效果研究 . 36 料與方法 . 36 粒、病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 36 要試劑 . 37 核表達(dá)質(zhì)粒 構(gòu)建 . 37 質(zhì)體的制備 . 38 粒及脂質(zhì)體質(zhì)?；旌弦旱闹苽?. 38 驗(yàn)動(dòng)物免疫 . 38 異抗體的檢測(cè) . 38 鼠 T 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) . 39 毒試驗(yàn) . 39 果 . 39 核表達(dá)質(zhì)粒 構(gòu)建 . 39 質(zhì)體形態(tài)觀察 . 39 異抗體水平的動(dòng)態(tài)變化 . 40 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) . 41 毒試驗(yàn) . 41 論 . 41 第六章 口蹄疫基因疫苗對(duì)牛的免疫效果研究 . 43 料與方法 . 43 粒、病毒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 . 43 要試劑 . 44 質(zhì)體的制備 . 44 粒及脂質(zhì) 體質(zhì)粒混合液的制備 . 44 驗(yàn)動(dòng)物免疫 . 44 異抗體的檢測(cè) . 44 牛外周血淋巴細(xì)胞 增殖試驗(yàn) . 44 毒試驗(yàn) . 45 果 . 45 異抗體水平 . 45 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) . 45 毒試驗(yàn) . 46 論 . 46 第七章 結(jié) 論 . 48 第八章 文獻(xiàn)綜述 . 49 因疫苗的免疫機(jī)理 . 49 般特點(diǎn) . 49 肉注射及皮內(nèi)基因槍接種基因疫苗的免疫機(jī)理 . 49 因疫苗免疫接種途徑及方式 . 50 疫途徑 . 50 種方式 . 52 疫佐劑在基因疫苗研究中的應(yīng)用 . 53 胞因子 . 54 . 56 學(xué)佐劑 . 58 刺激信號(hào)分子 . 61 學(xué)因子 . 61 附分子 . 61 化細(xì)菌體 . 62 毒載體 . 62 因疫苗研究新進(jìn)展 . 63 因組免疫 （ 或表達(dá)庫(kù)免疫 （ . 63 因免疫毒素 （ . 63 因免疫 . 63 因疫苗靶向細(xì)胞腔或細(xì)胞表面 (NA to or . 64 合抗原 NA . 64 免 - 蛋白 / 病 毒 加 強(qiáng) 免 疫 (. 65 因疫苗的應(yīng)用前景 . 65 參考文獻(xiàn) . 66 致 謝 . 79 附 錄 . 80 作者簡(jiǎn)歷 . 92 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 第一章 序言 1 第一章 序 言 究背景 口蹄疫病毒（ 于小 毒科（ 蹄疫病毒屬（ 有 O 型、 A 型、 C 型、 （南非型）、 （南非型）、（南非型）、 （亞洲型）等七個(gè)血清型 ,各型之間無(wú)交叉保護(hù)反應(yīng)。 因組為長(zhǎng)約 單股正鏈 有單一的開(kāi)放閱讀框，由基因、 構(gòu)蛋白基因、 3 非結(jié)構(gòu)蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成，該閱讀框翻譯產(chǎn)生的多聚蛋白前體在病毒自身編碼的蛋白酶作 用下，加工成病毒粒子組裝及復(fù)制所需要的結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒蛋白 體由蛋白酶 3C 裂解為 些蛋白能夠自我組裝成二十面體的核衣殼，隨著 解為 毒 裝進(jìn)病毒衣殼形成完整的病毒粒子 (et 995; et 1990; et 1989)。缺乏核酸的病毒衣殼由于包含 夠誘導(dǎo)與感染性 子相同的免疫反應(yīng)，尤其是這種衣殼能夠誘導(dǎo)與完全病毒粒子相同的特異性中和抗體 (et 975)，其中 因是 要的免疫原性基因，含有細(xì)胞抗原表位 (141 160細(xì)胞抗原表位 (200 213能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。另外 ,細(xì)胞抗原表位區(qū)構(gòu)成的“ 暴露在病毒粒子的表面，環(huán)內(nèi) 氨酸甘氨酸天門(mén)冬氨酸 )序列高度保守是病毒和宿主細(xì)胞結(jié)合的特異性位點(diǎn) (et 1999; et 2000; et 1987)。非結(jié)構(gòu)蛋白 2B 和 3D 在自然宿主中也是細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng) 的潛在刺激因子，將其作為基因疫苗構(gòu)成成分注射后能誘導(dǎo) T 細(xì)胞的高度增殖和遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng) (et 1985;et 1985)。 口蹄疫 (由 起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病， 30 余種家畜及野生動(dòng)物可感染本病，最易感動(dòng)物有牛、豬、羊、駱駝、鹿等；該病傳播途徑多、傳播速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)發(fā)生大流行；雖然該病的致死率不高 (幼畜除外 )，但可引起動(dòng)物生產(chǎn)性能下降；該病的暴發(fā)影響國(guó)際貿(mào)易，往往造 成慘重的直接及間接的經(jīng)濟(jì)損失，如 1997 年我國(guó)臺(tái)灣、 2000 年日本和韓國(guó)、 2001 年英國(guó)暴發(fā)的口蹄疫使該地區(qū)或國(guó)家畜牧經(jīng)濟(jì)遭受了沉重的打擊 (et 2001)。為此，世界各國(guó)非常重視對(duì)口蹄疫的研究。正因?yàn)榭谔阋呶：?yán)重，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和國(guó)際獸疫局將其列為 A 表中第一位烈性傳染病。目前對(duì)于該病的防制主要采取屠殺、隔離和免疫接種，其中疾病流行前的免疫接種是特異性保護(hù)家畜免遭感染的有效手段，大部分流行口蹄疫或受威脅的國(guó)家或地區(qū)都采用疫苗防制政策，而安全有效的疫苗是成功防制乃至最終消滅口蹄疫的先決 條件?？谔阋呷醵疽呙绾蜏缁钜呙绲葌鹘y(tǒng)疫苗都具有良好的免疫原性，事實(shí)證明，這些傳統(tǒng)口蹄疫疫苗在該病防制策略的實(shí)施中發(fā)揮了重要的作用，但由于其具有熱不穩(wěn)定性、僅誘導(dǎo)血清型特異性免疫反應(yīng)和短效的保護(hù)力以及為保證生產(chǎn)和運(yùn)輸中的安全而造成的高成本等缺點(diǎn)，尤其是近年來(lái)歐洲口蹄疫的爆發(fā)可能與疫苗中未完全滅活的病毒或病毒從疫苗生產(chǎn)地逃逸有關(guān)，使人們對(duì)傳統(tǒng)疫苗的安全性產(chǎn)生了懷疑，因此，有必要開(kāi)發(fā)一中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 第一章 序言 2 種更安全、有效的新型口蹄疫疫苗。 近年來(lái)，生物工程技術(shù)及免疫學(xué)的迅速發(fā)展為研制口蹄疫新型疫苗提供了條件，以致在近十幾年里，口蹄疫疫 苗在亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、抗獨(dú)特型疫苗、核酸疫苗方面的研究均取得了很大進(jìn)展，但由于基因疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)程類似于病原微生物自然感染或減毒活疫苗的接種，而克服了減毒活疫苗可能返祖或變異的缺點(diǎn)，而且基因疫苗具有比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，便于保存和運(yùn)輸；可同時(shí)引起體液免疫和細(xì)胞免疫，保護(hù)力強(qiáng)；對(duì)不同亞型的病原體有交叉抵抗作用；質(zhì)量易于控制和評(píng)價(jià)，可避免生產(chǎn)過(guò)程中病原的污染；操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)迅速、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，使基因疫苗成為疫苗研究中的熱點(diǎn)，甚至將其稱為自傳統(tǒng)疫苗、亞單位疫苗之后的第三代疫 苗?？谔阋呋蛞呙绲南嚓P(guān)研究也取得了很大進(jìn)展，本文將對(duì)此作出系統(tǒng)闡述。 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 基因疫苗（ 稱 苗（ 核酸疫苗（ 是一種將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的真核重組表達(dá)載體直接注射機(jī)體，在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因，誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病目的的新型疫苗。 蹄疫基因疫苗的構(gòu)成 口蹄疫基因疫苗一般由兩部分組成，即保護(hù)性抗原基因和真核表達(dá)質(zhì)粒載體，保護(hù)性抗原基因可以 是編碼 412001(et 2000;李光金 等 , 2001; 李光金 等 , 2001; et 2002)，也可以是單個(gè)基因（如 (et 2001) 或一組基因（如 2A、 3C、 3D） (et 1997; et 1998; et 2001; et 2001)，甚至 可以是口蹄疫抗原編碼基因與其他具有協(xié)同保護(hù)功能的基因連在一起（如 重鏈恒定區(qū)） (et 2000; 李光金 等 , 2001; 李光金 等 , 2001; et 2002)。在選擇抗原時(shí)，必須對(duì)口蹄疫病毒的相關(guān)分子生物學(xué)和免疫學(xué)知識(shí)深入了解，尤其要了解哪些基因的產(chǎn)物具有較好的抗原性，能否誘導(dǎo)最具保護(hù)力的免疫應(yīng)答。由于口蹄疫病毒有不同的亞型，該類病原的基因疫苗應(yīng)選擇較保守的保護(hù)性抗原基因。同時(shí)還要分析保護(hù)性抗原基因中是否含有稀有密碼子、有無(wú)內(nèi)含子以及能否在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 正確剪接等。 口蹄疫基因疫苗選擇的載體主要是可在真核細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，大多以 些質(zhì)粒均帶有細(xì)菌復(fù)制子及真核生物的啟動(dòng)子，大部分還含有增強(qiáng)子和多聚腺苷酸（ 尾信號(hào)。不同類型的啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子、內(nèi)含子序列、翻譯啟始序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等調(diào)控元件可直接影響基因表達(dá)效率，其中啟動(dòng)子類型是影響外源基因表達(dá)的主要因素。多數(shù)啟動(dòng)子來(lái)源于病毒基因組，其中源于巨細(xì)胞病毒（ 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較高，應(yīng)用也最多，而且?guī)в袃?nèi)含子的 動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性更勝一籌。因此， 動(dòng)子常作為評(píng)價(jià)其他質(zhì)粒 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄活性的標(biāo)準(zhǔn)，如人的橋粒蛋白啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子 (et 2000)、人的延伸因子 1動(dòng)子 (et 1999)、鼠肌肉肌酸激酶基因 (et 2000)及勞斯肉瘤病毒（ 末端重復(fù)區(qū) (et 2000)等。已經(jīng)證實(shí)，這些啟動(dòng)子能夠誘導(dǎo)與 動(dòng)子同樣有效的免疫反應(yīng)，如人的橋粒蛋白啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子能誘導(dǎo)抗乙肝病毒表面抗原（ 高水平抗體反應(yīng)及細(xì)胞毒性 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士論文 第一章 序言 3 甚至誘導(dǎo)了抗 型嗜人 et 2000)；人的延伸因子 1動(dòng)子誘導(dǎo)了直接針對(duì)病肝病毒（ T 細(xì)胞反應(yīng)；而由鼠肌肉肌酸激酶基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的弱抗原的表達(dá)足以誘導(dǎo)抗皰疹病毒（ 特異性免疫反應(yīng)。根據(jù)強(qiáng)啟動(dòng)子可以誘導(dǎo)抗原基因高效表達(dá)及更高水平的免疫應(yīng)答，而弱啟動(dòng)子可能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的持續(xù)性免疫應(yīng)答，在研制不同的口蹄疫基因疫苗時(shí)必須考慮應(yīng)用不同的啟動(dòng)子。 現(xiàn)以 ） 為例說(shuō)明其內(nèi)部各個(gè)基因序列的功能。 ）質(zhì)粒載體以 一種常用的非融合蛋白類型的高效真核表達(dá)載體。它除了具有多克隆位點(diǎn)（ 原核篩選標(biāo)記（ 原核復(fù)制啟始點(diǎn)（ ，還具有其特征的基因元件，如保證重組蛋白有效、高水平表達(dá)的人巨細(xì)胞病毒（ 期啟動(dòng)子 /增強(qiáng)子；可供重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄 /翻譯檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的 菌體 合酶結(jié)合的啟動(dòng)子，即它為 合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)；使 腺嘌呤化和轉(zhuǎn)錄