【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）配合飼料中蛋白質原料的溯源技術研究動物營養(yǎng)與飼料科學碩士論文

密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 配合飼料 中 蛋白質原料 的 溯源技術研究 on of on of I 摘 要 當前， 飼料 質量安全問題 引發(fā) 的 食品安全危機 的頻繁爆發(fā) 使得 如何 更好地對飼料產品原料來源和組成進行溯源管理 成為廣大 飼料管理者、科研工作者、生產者和消費者廣泛關注 的焦點 。近紅外光譜（ 析技術具有快速，準確，操作簡便，無損，成本低，且測量重復性 高的優(yōu)點，是一種在飼料質量安全等眾多領域都有著廣泛應用前景的溯源技術 ； 熒光定量 術可以對飼料中不同物種的基因目標片斷進 行擴增，從而對飼料組分來源進行判別。本論文分別建立了配合飼料中 豆粕、魚粉兩種成分的 熒光定量 性和定量檢測方法，并對兩種檢測方法進行了比較，為兩種方法在飼料質量溯源管理中的推廣應用提供 了 理論基礎。本研究的主要結論如下： 篩選 了 來源于編碼魚線粒體 12S 242基因片段、來源于編碼大豆線粒體 成酶的 137因片段和編碼大豆線粒體 18S 142因片段，用作 驗中對配合飼料中魚粉和豆粕成分進行定性檢測內源標記物；利用熒光定量 術分別建立了預測配合飼料中 魚粉、豆粕 含量的標準曲線， 魚粉 標準曲線 的決定 系數 兩種 豆粕 特異引物得到的標準曲線的決定系數分別為 以上標準曲線預測未知樣品中的魚粉和豆粕含量，預測值與真實值的相關性分別為 見， 術用于魚粉、豆粕的定性和定量檢測結果 尚可接受 ，但 仍有 很多不可控因素 限制了該技術的應用。 利用 術建立了魚粉、豆粕的 標模型，模型的決定系數 別達到 分別為 小于 10%， 大于 3，定標效果良好。通過預測未知樣品對所建模型的預測能力進行驗證，定性預測的準確度較高。 定量預測時， 未知樣品中魚粉、豆粕的 測值與真實值間決定系數 別達到了 0%， 大于 3，預測精度很好 。結果表明， 術可以很好的對配合飼料中魚粉、豆粕兩種蛋白質原料進行定性和定量 預測 ，實現對配合飼料蛋白質 來源 的跟蹤 溯源， 保障 飼料質量。 總之，本實驗 對 利用 熒光定量 術 和 術 對配合飼料 中 的魚粉 和 豆粕進行溯源（定性和定量）進行了 新 的探索 ，取得了較為滿意的結果， 這兩種技術 可做為對飼料質量 安全 進行有效溯源管理的新 手段 。 關鍵詞 ： 近紅外光譜（ 析技術 ， 實時定量 術 ， 溯源 ， 定性 ， 定量 n of on no to is a of to of of of it is an in CR a to in of in in in 43 bp of TP 32 bp of 8S 24 bp of 2S of in CR of R2 of of We of in in of by 2 of of 00% M. be to of In of by A of 錄 第 一章 緒論 . 1 究目的和意義 . 1 料質量安全評價 . 1 料質量安全評價的重要性 . 1 料質量安全評價的發(fā)展 . 1 蹤評價配合飼料原料組成的必要性 . 2 源管理的發(fā)展 . 3 源的起源 . 3 源技術 . 3 源技術在食品和飼料安全管理中的應用 . 4 國的飼料產品溯源管理機制亟待完善 . 4 究內容與方法 . 5 究內容 . 5 究目標 . 5 術路線簡介 . 5 第二章 術及其在飼料工業(yè)中的應用 . 6 紅 外光譜技術（ . 6 紅外光譜技術的原理 . 6 紅外光譜分析過程 . 6 紅外光譜分析方法 . 7 . 8 子數的確定 . 9 . 10 . 11 . 11 . 12 定飼料各種化學成份指標 . 12 定飼料消化特性等綜合指標 . 13 紅外與飼料生產在線監(jiān)控 . 13 料原料來源分析 . 14 酸分子檢測技術（ . 14 聚酶鏈式反應（ 術 . 14 時熒光定量 . 15 粒體 物種鑒別中的應用 . 16 . 17 第三章 術溯源配合飼料蛋白質原料方法的 研究 . 18 料與方法 . 18 . 18 劑 . 19 要儀器 . 19 . 19 物設計及合成 . 20 . 21 光定量 . 21 果與討論 . 23 . 23 光定量 . 26 結 . 30 第四章 術溯源配合飼料蛋白質原料方法的研究 . 31 . 31 品制備及處理 . 31 驗儀器 . 31 劑 . 33 紅外光譜采集 . 33 學分析 . 33 標模型建立及評價 . 33 證及預測結果的判斷 . 34 果與討論 . 34 配料樣品配方及待測指標含量分布 . 34 品近紅外光譜圖 . 37 譜數據處理方法的確定 . 38 譜范圍選擇 . 41 合飼料中豆粕的定性和定量分析 . 43 合飼料中魚粉的定性和定量分析 . 46 結 . 49 第五章 種方法的比較 . 51 . 51 . 51 . 51 . 52 結 . 52 第六章 結論及展望 . 53 要結論 . 53 種方法的比較 . 53 新點 . 53 一步研究設想 . 54 參考文獻 . 55 致謝 . 62 作者簡歷 . 63 V 英文縮略表 英文縮 寫 英文全稱 中文名稱 A 相對吸光度 工神經網絡 立葉變換中紅外光譜 階平滑 階 平滑 量命中指數 鄰近法 氏距離法 元線性回歸 元散射校正 位素比值質譜 紅外透射光譜 紅外反射光譜 磁共振 光度值 成分 成分分析 成分回歸 合酶鏈式反應 最小二乘法 um 測殘差平方和 定系數 制性片段多態(tài)性 正標準差 部交互驗證均方差 測均方差 對分析誤差 對標準差 時熒光定量 互 驗證標準差 階卷積 階卷積 步多元線性回歸 噪比 準正態(tài)變換 準正態(tài) 變換與去趨勢變換 鏈構象多態(tài)性 中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究目的和意義 飼料作為人類食物鏈中的重要一環(huán)，其質量與人類健康和食品安全緊密相關；特別是近年來由飼料質量安全問題引 起的 食品安全危機 頻發(fā) ， 造成了 人們的恐慌 。而 采用 不同的飼料原料，特別是質量不同的蛋白質原料， 不僅影響飼料產品和畜產品的質量水平， 而且 決定了 飼喂動物時 飼料 的實際營養(yǎng) 價值 ， 因此 如何更好的評價飼料質量和對飼料進行溯源已 經 逐漸 成為 研究者 們 關注的焦點 。但 現有的 很多飼料質量 檢測 技術 和溯源方法 成本高，且操作復雜，耗時長，不能快速得到 準確 的 實驗結果， 建立 高效簡便的飼料原料溯源方法成為 亟待 解決的問題 。 析技術和熒光定量 術 是兩種 相對 快速，且具有相當準確度的溯源（定性和定量）技術，已成功用于 農業(yè)、石油 化工 等眾多領域 ， 本研究探索 了 其 在 飼料 溯源 上 的應用 。 料質量安全 評價 料質量 安全 評價 的重要性 我國飼料工業(yè)經過 20多年改革與發(fā)展，已經 形成 包括飼料加工業(yè)、飼料添加劑工業(yè)、飼料原料工業(yè)、飼料機械制造工業(yè)和飼料科研、教育、標準、檢測等 在內的 較 為完備的飼料工業(yè)體系。2006年 我 國飼料 工業(yè) 產品總產量 達到 已 連續(xù)多年穩(wěn)居 世界第二 ， 飼料工業(yè) 在 保障安全優(yōu)質的畜禽及水產產品供給，促進糧食 增值轉化，帶動農業(yè)經濟結構調整，以及 在 農民增收、農業(yè)增效和養(yǎng)殖產品競爭力增強等 方面 都 發(fā)揮了重要的作用 ， 已 經 成為 促進我國農業(yè) 經濟發(fā)展 和 新農村 建設的重要動力。 飼料質量安全是畜牧業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展、動物源性食品安全、生態(tài)環(huán)境安全、乃至公共安全的基礎保障 ，確保和提高飼料產品安全水平是我國飼料工業(yè)“十一五”發(fā)展規(guī)劃的重要目標。 由于我國飼料生產、經營的基礎設施相對薄弱，飼料 生產、經營者法律意識和衛(wèi)生意識淡薄，加上我國當前存在著比較嚴重的環(huán)境污染問題，濫用農藥現象得不到有效 控制 ，導致飼料原料存在嚴重的農藥殘留問題 ， 而 原料摻雜使假等不法行為使 得 飼料 質量 安全問題 更為 嚴重 。 如何更好的監(jiān)控飼料質量安全、提高飼料管理法規(guī)的 威懾力、增強從業(yè)者的自律和責任感已成為提高 飼料質量安全 水平的 瓶頸 問題 ； 因此，創(chuàng)新 和 發(fā)展科學的 質量 安全 控制方法和 高效的檢測技術 逐漸 引起 廣大消費者的高度關注，也對 科研工作者 提出了更高的要求和嚴峻挑戰(zhàn)。 料質量 安全評價 的 發(fā)展 人們對 飼料產品，特別是飼料原料 質量水 平 的檢測分析和基礎數據 的 收集已有 很長 歷史， 這中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 緒論 2 些 指標 最初 主要 包括 水分、粗蛋白質、粗脂肪、無氮浸出物、粗纖維和粗灰分等 簡單的化學成分 ，和感官指標等 。 隨著動物營養(yǎng)學和分析化學等相關基礎理論和分析技術的發(fā)展，人們 逐漸 將氨基酸組成平衡、凈能 、消化率 、抗營養(yǎng)因子、有毒有害成分 等 深入評價飼料 質量 的 指標 納入 了 飼料質量 安全 評價體系中。 與此同時 ，相應的質量安全 評價技術也 在 不斷發(fā)展完善，除了常規(guī)化學成分分析外，高效液相色譜、原子熒光分光光度計、氣相色譜、氨基酸分析儀、氣質聯用 、 近紅外光譜分析儀等大型先進精密的分析儀器 也被用于 飼料 質量的深入評價 中 ， 并 建立 了 相應的 更 準 確快速 的飼料質量 分析 方法。 隨著經濟的發(fā)展，食品安全問題越來越受到社會的關注。飼料作為養(yǎng)殖業(yè)的必備 投入品 ，其安全衛(wèi)生問題直接或間接地影響到動物產品 質量 和人類的安全，是保證食品質量安全關鍵的一環(huán)；食品安全首先是飼料的安全，飼料安全即食品安全的共識已在世界范圍內形成。提高飼料質量，保障飼料安全，從而保障動物產品和人民健康已成為世界 各國政府 的重要職責。 特別是 從 上世紀80 年代英國爆發(fā) “瘋牛病” 事件 以來， 各國政府 都在 加快建設飼料質量安全監(jiān)管體系 和創(chuàng)新發(fā)展安全評價方法， 并 先后將可追蹤管理機制引入到 飼料 質量安全 管理中 ， 而一系列以蛋白質、植物次級代謝物、功能基因和 C 同位素等為物種鑒別參照的溯源技術逐漸出現在 飼料 安全管理領域，并得到越來越多的應用和 快速 發(fā)展。 蹤評價配合飼料原料組成的 必要性 配合飼料 養(yǎng)分全面且平衡，能夠滿足飼養(yǎng)動物的各種營養(yǎng)需要， 通過 推廣 配合飼料的 使用 以增強 對 質量安全隱患的防控 也 得到越來越廣泛的認可 。 配合 飼 料 在 飼料工業(yè) 中的 地位舉足輕重 。保證 配合飼料的 質量安全是提高畜禽生產性能的基礎，直接決定 了 畜禽生長狀態(tài)和畜產品 質量安全 水平 ， 也 是養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展 的基礎 和 動物性食品安全 的重要 保障 ，更會影響人類的健康 與安全，因此 在生產和管理中采取有效手段 保證配合飼料質量的穩(wěn)定十分重要 。 要全面有效的控制 配合 飼料質量安全，不僅要在飼料 生產 加工 、 運輸 、 儲存 等環(huán)節(jié) 對飼料質量進行 監(jiān)控，更重要的是 從源頭控制和 確保飼料 原料的 質量 安全。 這是因為： 首先 ，隨著 畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和 人們 生活水平的提高，飼料原料資源 匱乏問題越來越突出， 使用大量的非常規(guī)飼用資源和不斷開發(fā)新資源成為必然趨勢， 而要 實現對這些非常規(guī)資源的安全評價需要一個較長的歷史時期， 需要全程 監(jiān)控和 詳細 記錄這些新資 源的生產使用情況， 因此有必要 對這些原料進行溯源管理 。 其次 ，飼料工業(yè) 依靠種植業(yè)，服務養(yǎng)殖業(yè) ， 因此 飼料原料的質量評價 不僅 將 給 作物 育種工作提供方向和重要的參考數據，也影響著管理者對種植業(yè)結構的引導和調整 。 再次 ， 動物 對由不同原料生產出的營養(yǎng)成分含量相同的配合飼料的最終利用率 可能會 大不相同 ， 這是 因為 不同來源飼料原料 的 物質結構、營養(yǎng)成分等生物化學特性有明顯差異， 不同飼料原料中含有不同的抗營養(yǎng)因子，直接影響飼養(yǎng)動物對營養(yǎng)成分的酶解速度和消化吸收率 ， 并且 畜禽在各自的進化過程中形成的體內消化吸收系統(tǒng)、消化酶的組成對飼料原料 也 具有一定的選擇性 ，因此 動物對 不同飼料原料的 消化和吸收利用速度和程度不同 。 總之， 飼料原料直接影響動物的生長性能，免疫狀態(tài)和安全水平， 飼料原料組成是影響 配合 飼料質量水平的一個重要 決定因素和參考指標 ， 有必要 盡快 研究出對 配合飼料原料組成 進行 跟蹤評價 的 方法 。 中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 緒論 3 源管理 的發(fā)展 源的起源 溯源是 農產品質量安全管理體系中的重要 手段 ， 其 通用定義起源于 1986年 國際標準組織 的 義為通過登記的標識溯源某一 產品 的歷史 、 應用或 位置 （ 003） 。 此定義 一方面涵蓋 了 產品 的來源，即回溯來源 ；另一方面涉及了產品 的生產模式，即溯源加工過程 。 追溯產品 來源涉及到 產品 的特征 、 種類及地理來源 等指標 ， 通常這些指標參數將直接影響產品的 質量 安全 水平。溯源過程涉及 到 產品 生產體系，包 括 加工和儲存過程 ， 及 摻假 等影響產品 質量安全 的任何 行為 。 最 初， 溯源 只 被 用 來 驗 證 受 原產地名稱 保護的 產品和 區(qū)分 功能相近的 市場 商品 。 但 隨著 瘋牛病 等事件 的 爆發(fā)， 以及消費者對消費“ 綠色 ” 動物產品興趣 的增加和 對 動物福利 的 重 視， 消費者逐漸要求了解動物飼料的詳細 信息； 另外， 政府職能部門和 產品認證機構也需要一種控制手段，以 客觀地 保證 所制定相關法規(guī)的貫徹和遵從， 并 確保認證 產品的 規(guī)格說明 和 承諾已 被 完全兌現 。鑒于 以上種種 原因 ， 溯源 管理 開始 被 用于控制 飼料和 食品 的質量 安全。 源技術 溯源技術 有 多種 ，不同方法的適用范圍不同 ， 但 其原理 通常 都 是通過分析與產品來源相關的特征信息， 進一步與已建立的 參照標記數據庫信息 進行對比，最終確定產品的來源。 目前用于動物飼料 溯源 的方法有四類。一類是利用飼料中植物原料的生物代謝物標記法，即利用飼料中含有的而動物機體自身不能合成的、并將在動物產品或組織中出現的，完全是因為動物食用飼料而出現的化合物作為溯源 標記，例如類胡蘿卜素、 二級萜類化合物、酚類和植物烯類等（ 007； ， 2004； ， 1985； ， 1997） 。第二類是利用來源于動物新陳代謝的代謝指標法（間接標記法），如通過分析動物產品中亞油酸，及其衍生物 不飽和脂肪酸的組成含量，判斷動物所食用的飼料原料組成（ ， 1997； ； 2000）。 第三類是物理標記法，即 通過檢測 放射性同位素含量 分析飼料原料的組成， 利用 物理化學技術進行溯源的技術（ ； 2004a， b），如 離子交換色譜 /原子吸收光譜、核磁共振與 同位素比值質譜 聯用（ 核磁共振 場地特定天然同位素分餾法 (。 還有 一類 為綜合指標方法，包括利用 光譜學 方法，如中紅外和近紅外光譜 （ 、 傅立葉變換中紅外光譜（ 熒光光譜 等技術，以及 生物學技術 進行飼料原料組成的分析 ， 如 傳統(tǒng)生化技術（抗生素分析 、 酶聯免疫測試等） 和 分子生物學技術（變性梯度凝膠電泳和單鏈構象多態(tài)性） 等 。 溯源技術的 選擇很大程度上取決于前期的基礎研究（對研究對象 特征信息 的了解程度） 。 對 產品 來 源的描述可能是來自多種分析技術 的共同結果 ， 應用相關溯源分析技術后就會產生相應 的初步 溯源結果，而后這 些 結果再經過數學或統(tǒng)計學方法分析和處理，得到最終的溯源結果。 中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 緒論 4 源 技術 在 食品 和 飼料安全 管理中的應用 近年來各種食品 和飼料安全事故 頻 發(fā) ，尤其是瘋牛病、 禽流感 、蘇丹紅等 食品安全危機使廣大消費者對食品安全和飼料安全問題心有余悸。為了樹立消費者對食品質量安全的信心，一些發(fā)達國家紛紛實施食品 和飼料 質量安全追溯制 度 ，不斷加強對食品的生產、儲存、運輸和銷售各個環(huán)節(jié)的控制，在生產環(huán)節(jié)建立驗證和注冊體系，強制性實行食 品生產和銷售情況透明度政策，強化可追溯制度的實施。 歐盟法規(guī) 002要求從 2004年起在歐盟范圍內銷 售 的所有食品都能夠進行跟蹤與追溯，否則就不允許上市銷 售 。 同時，從 2005年歐盟開始實施水產品貿易追溯制度。 另外，針對轉基因生物的問題， 歐盟 也出臺了很多與溯源管理相關的法律法規(guī)，如 轉基因生物環(huán)境釋放法（ 2001） 、（ 1829/2003、 （ 1830/2003、 （ 65/2004、 （ 641/2004等， 這些法規(guī)對 進入環(huán)境的轉基因生物，新的轉基因食品和飼料產品 的 審核 批準 ， 對 存在于和 由于偶然或技術上無法避免的原因而存在于產品中的轉基因原料的標注，及對 轉基因生物 和 由轉基因生物制成的食品和飼料產品 進行 溯源和標注 等問題作出了詳細規(guī)定 。 美國對美國本土 的和 對美出口的食品和飼料等要求在進行追蹤與溯源；另外還建立 了 家畜追溯系統(tǒng)，提高從農場到加工廠的追蹤鑒別能力，以防范瘋牛病、口蹄疫等問題。日本也 建立 了相應的追溯體系，對與消費者有關的所有農產品、食品和飼料的溯源等都作出了規(guī)定。 國 的 飼料產品溯源管理機制 亟待 完善 隨著社會經濟的迅速發(fā)展、人民生活水平的不斷提高，消費者 對畜產品的需求已漸漸由“量變”轉為“質變”，整個社會和廣大人民群眾對畜產品的質量安全問題提出了更高的要求 ，而飼料產品質量安全是影響畜產品質量安全的直接因素 ； 因此， 要求 我們不斷完善飼料工業(yè)的溯源管理體系 。 在飼料工業(yè)中應用溯源技術，有利于飼料安全問題的防控與解決；有利于明確飼料生產 /經營者的責任；能夠為貫徹實施飼料監(jiān)管法規(guī)提供技術支持；通過溯源技術分析辨別配合飼料原料組成，可以更科學的評價飼料品質；而且對飼料工業(yè)實行嚴格的溯源管理也是整個食品鏈溯源管理中的重要一環(huán)。 對飼料產品質量安全進行跟蹤與追溯不僅是我國飼料 工業(yè)“十一五”發(fā)展規(guī)劃確定的重要任務，也是當今世界發(fā)展的一個方向， 是 大勢所趨。 我國 飼料生產、質量檢測體系和飼料相關基礎學科 發(fā)展的 基礎薄弱， 飼料生產企業(yè)生產規(guī)模和技術水平參差不齊，各種與飼料產品質量安全相關的基礎信息庫嚴重缺乏，溯源技術和檢測標準體系發(fā)展明顯滯后于飼料工業(yè)的發(fā)展， 并且 相關的法律體系 也 尚需進一步完善，這些問題制約著我國飼料工業(yè)溯源管理體系的建設和正常運轉 。 因此，研究建立 更為高效準確的 溯源技術 和 方法不僅具有 廣闊的 應用前景，而且具有明顯的社會意義。 中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 緒論 5 究內容與方法 究內容 研 究內容主要包括： （ 1） 探討近紅外光譜分析技術定性和定量檢測配合飼料原料組成的可行性； （ 2） 利用近紅外光譜分析技術溯源配合飼料中主要的蛋白質原料魚粉和豆粕 ，確定飼料的蛋白質來源 ；建立 相應的 定性判別分析和定量預測模型 ，并對模型進行驗證 ； （ 3） 篩選和確定可 作為對 配合飼料 中的 蛋白質 原料 （主要是 魚粉和 豆粕） 進行定性和定量檢測 的 內源標記物的基因片段； （ 4） 研究 對 配合飼料中主要的蛋白質原料魚粉和豆粕 進行 檢測 的 熒光定量 法； （ 5） 比較分析所建立的 近紅外光譜分析技術 檢測方法和熒光定量 測方法的準確性和重復性。 究目標 探索 利用近紅外光譜技術和熒光定量 術 ， 建立有效 檢測 配合飼料所用主要蛋白質原料 魚粉和豆粕 的檢測方法， 溯源配合飼料的蛋白質來源，推動 溯源管理 配合飼料原料組成的支撐技術 的 發(fā)展， 為更好的實施飼料質量管理 、 保證飼料質量安全提供一種更便捷有效的手段 。 術路線簡介 中國農業(yè)科學院 碩 士學位論文 第二章 術及其在飼料工業(yè)中的應用 6 第二章 術及 其 在飼料 工業(yè) 中的應用 紅外光譜技術 （ 紅外光譜技術的原理 近紅外光是指波長介于可見區(qū)與中紅外區(qū)之間的電磁波，其波長范圍為 8002500數范圍為 125004000。近紅外光譜 （ 技術 是指利用近紅外譜區(qū)包含的物質信息，主要用于有機物質定性和定量分析的一項分析技術（陸婉珍， 2000） 。 近紅外譜區(qū)主要是有機物含氫基團（如 ）的伸縮振動的各級倍頻和這些集團的伸縮振動與彎曲振動的合頻吸收，幾乎包含了有機物中所有含氫基團信息，蘊含著分子的結構、組成狀態(tài)等信息（吳瑾光， 1994） ， 從而為近紅外光譜分析樣本的物理性質（如粘度、粒度、硬度等）以及化學成分（如蛋白質、氨基酸、脂肪、淀粉、水分等）提供了可能。 利用近紅外光 譜分析技術可采集到構成樣品的所有有機化合物的組成和結構信息。通過綜合整理加工這些信息，一方面可獲得具有強特異性、且能夠準確反映被測樣品個性特征 的 信息；另一方面能夠獲得樣品近紅外光譜與有機化合物組成和結構間存在的一定對應函數關系，從而對樣品的物理化學特性做出預測。 基于近紅外光譜分析技術 的 特點， 它 不僅可以用于分析單一化合物的成分含量；而且利用其能夠準確采集被測產品個性特征信息的優(yōu)勢，同時結合圖像處理技術，還可將 其 用于被測樣品的溯源管理、贗品鑒別等。特別是近年來，電子技術、計算機技術、數學統(tǒng)計學理論、化學分析理論的發(fā)展，進一步促進了近紅外光譜分析技術在農產品質