【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）甘肅漢族人群SLC30A8基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性

1 前 言 近來年， 我國糖尿病患病人數(shù) 顯著 增加，而且發(fā)病年齡 呈現(xiàn)出 年輕化的趨向。調(diào)查顯示： 1980 年全國 13 省及北京市 30 萬人口進(jìn)行的糖尿病調(diào)查中，顯示糖尿病患病率為 1。 1995 1996 年 對全國 11 省市 20 75 歲 4 萬人群進(jìn)行糖尿病流行病學(xué)基線調(diào)查表明糖尿病的患病率已達(dá)到 。 2002 年全國糖尿病的流行 病學(xué) 調(diào)查 ，采 用空腹血糖 5.5 l 作為篩選指標(biāo)，高于此水平的人行 驗(yàn)。在 18 歲以上的人口中，城市糖尿病的患病率為 農(nóng)村為 城市中年齡在 18， 45和 60 歲以上者糖尿病患病率分別為 而農(nóng)村相應(yīng)年齡組為 2007 至 2008 年在中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會 織下，全國 14 個省市進(jìn)行了糖尿病的流行病學(xué)調(diào)查。通過加權(quán)分析，考慮性別、年齡、城鄉(xiāng)分布和地區(qū)差別的因素后，估計(jì)我國 20 歲以上的成年人糖尿病患病率為 調(diào)查顯示中 國成人糖尿病總數(shù)達(dá)9240 萬，其中農(nóng)村約 4310 萬，城市約 4930 萬。從 1980 年到 2008 年，在不到30 年間我國糖尿病患病率增加超過了 15 倍。中國可能已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家。另外， 供 的有關(guān)資料表明，糖尿病的患病率、致殘率和病死率對總體健康的危害程度， 已經(jīng) 居 于 慢性非傳染性疾病的第三位 ，僅僅次于心腦血管疾病和癌癥。另外，調(diào)查顯示在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家，糖尿病是主要的致死原因， 且 以 2 型糖尿病為主，而在許多發(fā)展中國家目前糖尿病已達(dá)到流行狀態(tài) 。綜上所述，糖尿病及其各種并發(fā)癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生存質(zhì) 量和社會發(fā)展的疾病， 未來 50 年內(nèi)糖尿病仍將是 我 國一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 目前我國糖尿病患病率急劇增加考慮可能有以下多種原因造成： 國城市化發(fā)展的進(jìn)程隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展明顯加快，我國城鎮(zhèn)人口比例在2006 年的調(diào)查顯示已上升至 43%。 年人的比例逐年增加， 2007年 的調(diào)查中 60 歲以上的老年人糖尿病患病率在 20%，比 20年齡階段的人患病率高 10 倍。調(diào)整其他相關(guān)因素后，年齡每增加 10 歲，糖尿病的患病率增加近 70%。 國城市中主要交通工具進(jìn)入了 汽車時代，人們出行的方式已經(jīng)發(fā)生很大的變化，體力活動明顯減少，而熱量的攝入在逐漸增多，脂肪攝入量及比率比例明顯增加，出現(xiàn)攝入大于消耗，過多脂肪在體內(nèi)儲存， 肥胖和超重的比例增加，調(diào)查顯示： 我國超重占人群中的 肥胖已達(dá)甘肅漢族人群 陳華琴 蘭州大學(xué) 二一三 2 到 5%, 超重及肥胖增長的幅度明顯增加。 著對糖尿病患者各種并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素控制以及治療水平的提高，糖尿病患者死于并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯下降，糖尿病患者的生存期明顯增加。 目前 我國糖尿病流行特點(diǎn)： 尿病 患病人群中，以 2 型糖尿病為主，2 型糖尿病占 90以上 ， 1 型糖尿病約占 5，其它類型糖尿病僅占 ， 妊娠糖尿 病 的患病率 約占 5%。 2. 糖尿病患病率與經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)程度 相關(guān) ：在 1994 年的調(diào)查中，高收入組的糖尿病患病率是低收入組的 2。最新的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)達(dá)地區(qū)的糖尿病患病率明顯高于不發(fā)達(dá)地區(qū)，城市高于農(nóng)村。 3. 未診斷的糖尿病比例高于發(fā)達(dá)國家： 2007 20 歲以上人全國調(diào)查糖尿病患者，新診斷的糖尿病占總 糖尿病患者 數(shù) 60%，遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家 (美國約 48%)。 4. 男性、低教育水平是糖尿病的易患因素：在 2007的調(diào)查中，在調(diào)整其他危險(xiǎn)因 素后，男性患病風(fēng)險(xiǎn)比女性增加 26%，而文化程度大學(xué)以下的人群糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加57%。 5. 表型特點(diǎn)：我國 2 型糖尿病患者的平均 體重指數(shù)（ 約在 25高加索人糖尿病患者的 均多超過 30 kg/后高血糖比例高，在新診斷的糖尿病中，單純餐后血糖升高占近 50%。 6. 目前 國內(nèi) 尚 缺乏兒童糖尿病的流行病學(xué)資料，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)，近年來 20 歲以下的人群中 2 型糖尿病患病率顯著增加。 我國目前糖尿病的分型采用的是世界衛(wèi)生組織 1999 年制定的糖尿病病因?qū)W分型體系。將糖尿病分為四類： 1. 1 型糖尿病型 2. 2 型糖尿病 3. 特殊類型的糖尿病 4. 妊娠糖尿病 。臨床的常見類型是 1 型糖尿病、 2 型糖尿病及妊娠糖尿病。 1型糖尿病病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，病理學(xué)特征是胰島 B 細(xì)胞數(shù)量顯著減少或消失，導(dǎo)致胰島素分泌顯著下降或缺失，目前認(rèn)為屬于 自身免疫性疾病。2型糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制目前不明確，其顯著的病理生理學(xué)特征為胰島 或胰島素抵抗所導(dǎo)致的胰島素在機(jī)體內(nèi)調(diào)控葡萄糖代謝能力的下降 , 或兩 者共同存在。特殊類型糖尿病是在病因?qū)W上相對明確的一些高血糖狀態(tài)， 相 對于 1型糖尿病及 2型糖尿病病因比較明確。 妊娠糖尿病是指懷孕前未患糖尿病，而在懷孕時才出現(xiàn)高血糖的現(xiàn)象，其發(fā)生率約百分之 五 。 隨著對糖尿病發(fā)病機(jī)制研究的深入，病因明確的糖尿病將逐漸增多，特殊類型糖尿病的種類會逐漸增加。 2 型糖尿病的病因尚未完全闡明。目前認(rèn)為不是唯一病因?qū)е碌膯我灰蛩丶膊?，而是?fù)合病因的綜合征，與遺傳、自身免疫、生活方式和環(huán)境因素均存在關(guān)系。 它 是由遺傳和環(huán)境因素共同作用而引起的以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的疾病，具有雙重的病理生理學(xué)機(jī)制 胰島 但具體病因尚不明確。 人 體內(nèi)的 糖主要來自于食物的攝取和肝臟的糖異生。雖然進(jìn)食是周期性的，但是胰島組織分泌的胰島素和胰3 高血糖素的調(diào)節(jié)、小腸對葡萄糖的吸收、胃腸分泌的小分子肽對胰島組織的分泌活動的影響、肝臟在激素刺激下糖原合成和糖異生的調(diào)節(jié)以及外周組織對葡萄糖的吸收和代謝相互平衡使血糖控制在一個很窄的范圍內(nèi) (4-7 )。 目前糖尿病研究主要分為幾大方面：胰島 周組織對胰島素的響應(yīng)性、胃腸道的影響和基于基因水平上的易感性研究等。 近年來 基因多態(tài)性 的 研究 ， 使得臨床醫(yī)生將有可能 判斷 ，在同樣的致病條件下，不同的個體會出現(xiàn) 什么樣的 臨床表現(xiàn) 及 病理反應(yīng)。按照基因多態(tài)性的特點(diǎn) 給予針對性的 用藥，將會使臨床治療 更加 符合個體化的要求。 例 如高血壓的治療，將根據(jù)基因多態(tài)性的研究 ，判斷高血壓產(chǎn)生的病因， 選擇更具針對性的藥物，而不是 一味地、 不加選擇地使用 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 、鈣拮抗劑 、利尿劑或 。 而一些 合并癥 、并發(fā)癥 的防治也會更個體化，更 具有目的 性。 如前所述， 一種多基因病，它具有明顯的遺傳異質(zhì)性、表型復(fù)雜性及種族差異性等特征，多個微效基因通過直接或者間接的關(guān)系 ， 對該疾病的易感性產(chǎn)生了累積的效應(yīng)。已經(jīng)研究的關(guān)于 2型糖尿病及 其并發(fā)癥的候選基因主要有島素分泌調(diào)節(jié)、脂代謝、糖代謝、腎素 溶穩(wěn)定系統(tǒng)及相關(guān)激素、受體、酶及載體的基因。 隨著 高通量單核苷酸多態(tài)性 (因分型技術(shù)發(fā)展迅速 , 全基因組關(guān)聯(lián)研究 （ 方法被廣泛應(yīng)用到疾病的遺傳學(xué)研究中 , 并取得了一系列研究成果。 在遺傳流行病學(xué)上，全基因組關(guān)聯(lián)研究 (一種檢測特定物種中不同個體間的 大部分或 全部基因 ， 人類 從而 可以 了解不同個體間的基因 存在 變化有多大的一種方法。不 同的 基因 變化帶來不同的性狀， 例如各種 不同 疾病 的發(fā)生 。在人類中，這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了特定基因與疾病的關(guān)聯(lián)，如糖尿病和 年齡相關(guān)性黃斑變性的眼部疾病 等 。 以遺傳為基礎(chǔ)的 復(fù)雜 、 常見 疾病提供了良好的研究前景 和方向 ，其常用的遺傳標(biāo)記就是 不同人群中， 及不同 ，這些差異可能就代表某一種族或人群間的遺傳變異，對它們的研究有助于 （ 1） 解釋個體的表型差異 。（ 2） 不同群體和個體 中 對疾病的易感性 。（ 3） 對各種藥物的耐受性 以及 對環(huán)境因素的反應(yīng) 2。 以前的連鎖分析和候選基因的方法已經(jīng)確定了 2 型糖尿病相關(guān)的 一些 基因，如 3 歐洲的原始種群中，是已知最強(qiáng)的與 關(guān)基因 10。全基因組關(guān)聯(lián)研究（ 提供了 新的發(fā)現(xiàn) 2 型糖尿病的基因方法 ，并取得豐富結(jié)果。例如，包括 B、 因，已表明與 1關(guān)。 但這些基因的功能4 和調(diào)控機(jī)制還不十分清楚 ，有待于人類進(jìn)一步研究證實(shí)。 全基因組關(guān)聯(lián)研究得出，編碼 基因 多態(tài)性與 2 型糖尿病的發(fā)生有關(guān) 21，且在不同種族有不同的研究結(jié)果。東亞地區(qū)單個易感基因可使患有 2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)性增加 16%，歐洲單個危險(xiǎn)基因可使患有 2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)性增加 14%，而非洲、印度、以色列未發(fā)現(xiàn) 因多態(tài)性與 2 型糖尿病相關(guān) 22。 21在法國人群中首次發(fā)現(xiàn) 因和 2 型糖尿病相關(guān)。 22證實(shí) 挪威人 的 因多態(tài)性 2 型糖尿病有關(guān)。 4等研究了印第安人中 因 點(diǎn) 2 型糖尿病的相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)與 2 型糖尿病及體 重 指數(shù)沒有相關(guān)性。在亞洲， 5等的結(jié)論，證實(shí) 增加日本人 2 型糖尿病的易感性； 26證實(shí)因多態(tài)性與韓國人 2 型糖尿病有關(guān)。國內(nèi) 27證實(shí) 型糖尿病、糖調(diào)節(jié)受損有關(guān)， 因型 患 2 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。黃勇 28等證實(shí)上海人群 態(tài)性與 2 型糖尿病相關(guān)。 一、 鋅與糖尿病的關(guān)系 鋅 (人體重要的微量元素之一 , 30 年代已經(jīng)證實(shí)胰島素晶體中含有鋅。鋅體內(nèi)平衡受 因家族 )和 庭 )鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)。 作用是減少細(xì)胞內(nèi) 鋅離子的水平，將鋅離子從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，而 加細(xì)胞內(nèi) 鋅離子的水平，將細(xì)胞外鋅離子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。據(jù)報(bào)道 ,當(dāng)前已確定人類 10 個 族的成員 ( 14 個 庭成員的( 大多數(shù) 胞質(zhì)氨基和羧基 而 運(yùn)蛋白有八個跨膜域。此外 , 在這兩個鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，鋅結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)跨膜域形成鋅運(yùn)輸孔隙。在胰腺 B 細(xì)胞膜上存在 達(dá)，并轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì) 。 胰島 胰島素原被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體內(nèi)與鋅結(jié)合，然后形成六聚體。離開高爾基體后 , 在胰蛋白酶、羧肽酶的作用下 , 水解成 胰島素濃縮形成 并以與鋅結(jié)合的形式貯存于胰 島 受到葡萄糖等刺激 , 島 顆粒膜與細(xì)胞膜融合釋放出胰島素。在胰島素的合成貯存過程中 , 鋅起著重要作用 ,胰島素原在 胰島 聚體形成 , 胰島素原水解酶的激活 , 胰島素濃縮和胰島 鋅缺乏時 , 胰腺 胰島素轉(zhuǎn)錄后或翻譯后水平的合成下降 , 與鋅結(jié)合發(fā)生交聯(lián)的能力改變。鋅也與胰島素的釋放密切相關(guān) , 胰島 而鋅和胰島素的釋放是平衡的。 如果血液中鋅足夠多 , 并且 胰島 則胰島素分泌 相對 減少 ； 如果血鋅降低 , 胰島 5 則胰島素可替代鋅的分泌增加 , 這也是造成高胰島素血癥 , 產(chǎn)生胰島抵抗的原因之一。所以微環(huán)境中含有充足的鋅 , 有利于胰島素的代謝 , 保護(hù) 胰島 以免過度的刺激導(dǎo)致 動物試驗(yàn)證實(shí) , 缺鋅時動物糖耐量受損 , 母體缺鋅時胚胎胰島素與胰高血糖素含量均減少 , 胰島 細(xì)胞數(shù)目也減少。這些表明鋅與胰島素、葡萄糖的代謝有密切的聯(lián)系。所以鋅在糖尿病發(fā)病過程中可能起著重要作用。 通過對影響鋅平衡 6個因素 (發(fā)鋅、血清鋅、尿鋅、腸鋅 表觀吸收率、血糖 /血清銅鋅 )進(jìn)行回歸分析 , 腸鋅 吸收率越低 , 24小時尿鋅排泄越多 , 鋅丟失越多，鋅負(fù)平衡越嚴(yán)重。血糖越高 , 則血清鋅含量越低 , 尿鋅排泄越多 , 腸鋅吸收障礙及負(fù)平衡越嚴(yán)重 29。何邦平等 30研究表明 , 糖尿病患者血清鋅顯著低于正常人 ,與胰島素和 與血糖呈顯著負(fù)相關(guān)。鋅在十二指腸吸收過程中 ,要與載體蛋白結(jié)合 , 糖尿病患者蛋白質(zhì)處于負(fù)氮平衡 , 可能影響鋅載體蛋白的合成 , 這將導(dǎo)致腸道鋅吸收障礙。另外 , 糖尿病患者控制飲食 , 鋅攝取可能不足 , 也是造成鋅缺乏的一個原因。 研究表明 ，高血糖能引起體內(nèi)鋅總量減少，而鋅的損失可能進(jìn)一步加重糖尿病。另外，氧化應(yīng)激與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)，應(yīng)用抗氧化治療可延緩其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，而鋅在細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中起著重要作用，若鋅量不足，氧化應(yīng)激則不可逆地?fù)p害細(xì)胞，加重并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。已經(jīng)有一些機(jī)理說明 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn) 相關(guān) 。更具體地， 是 風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)е?2型糖尿病患者 胰島 障礙 31敲除小鼠 島 功能 受損 糖耐量異常， 但并非所有的結(jié)果都一致的 33 另外， 在基因敲除 的小 鼠 發(fā)現(xiàn) ，高脂肪的飲食會導(dǎo) 致嚴(yán)重的胰島素抵抗，可能涉及到 肪組織 存在 不同的表達(dá) 36。越來越多的文獻(xiàn)表明， 工和分泌胰島 素是重要的。 二、 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 8（ 是 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體家庭 的一個成員 ， 調(diào)節(jié) 囊泡內(nèi)外鋅 濃度 37。編碼 基因 是 因，主要表達(dá)在胰腺中 A、 B 細(xì)胞 38 在睪丸和 頜下腺 等 有低水平的表達(dá) 。 位于胰島素分泌顆粒在 B 細(xì)胞 40，在那里它被認(rèn)為是需要提供鋅，以允許適當(dāng)?shù)某墒?，存?和分泌胰島素 37。 二聚體形式定位于 胰島 B 細(xì)胞上 ，調(diào)節(jié)胰島素分泌、儲存 囊泡膜上41, 調(diào)節(jié)胞漿和囊泡間的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)。 白可能含有多個位點(diǎn)，這些假定位點(diǎn)為 物學(xué)功能的分子機(jī)制研究提供了必要的線索。 白在人類和哺乳動物的結(jié)構(gòu)和功能相似，提示 白在鋅轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用 42。 外界的鋅濃度不能影響 胰島 B 細(xì)胞的鋅聚集量，而鋅轉(zhuǎn)運(yùn)或儲存的能力則影響鋅的聚集量。細(xì)胞內(nèi)含鋅量多 ， 達(dá)細(xì)胞會免于因鋅缺乏而誘導(dǎo)的凋亡。 當(dāng)6 白發(fā)生變異時，胰島 B 細(xì)胞囊 泡內(nèi)鋅離子濃度下降，胰島素六聚體明顯減少，囊泡內(nèi)胰島素水平降低 , 外界 高血糖刺激下分泌的胰島素相應(yīng)不足。胞吐作用時胰島素原不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素， 胰島 B 細(xì)胞分泌胰島素的功能損傷。白鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，導(dǎo)致鋅離子不能及時轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，也可破壞胞漿內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)。過量鋅離子積聚在胞漿中，當(dāng)其達(dá)到或超過毒性閾值可誘發(fā)大量 胰島 43。 大鼠胰島素瘤 胞實(shí)驗(yàn)表明， 白過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞攝取和儲存鋅離子增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鋅總含量 增加 44。 白也可作為抗原引起 T 細(xì)胞介導(dǎo)的以 甚至誘發(fā) ，引起 白異常，造成胰島素分泌減少，引發(fā)糖尿病。另外， 有研究報(bào)道 因多態(tài)性也 與同種異體腎移 植受者移植后糖尿病 45、妊娠糖尿病 46發(fā)病危險(xiǎn)性增高相關(guān) , 但具體機(jī)制尚未確定 。 三、 免疫系統(tǒng) 鋅對免疫細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié) , 對免疫功能它是必不可少的微量元素 47。鋅在先天和后天性免疫反應(yīng)中均是必需的。鋅對促炎細(xì)胞因子如白 介素 (腫瘤壞死(其他抗原刺激后 ,促進(jìn) T 細(xì)胞的增加顯得十分重要 48因此鋅缺乏引起胸腺萎縮 , 淋巴細(xì)胞減少 , 抑制細(xì)胞溶解的 T 細(xì)胞反應(yīng)、 自然殺傷細(xì)胞活性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生 50。鋅也從細(xì)胞因子誘導(dǎo)破壞保護(hù)胰腺 B 細(xì)胞，這用來觀察 1 型患者糖尿病 , 但也出現(xiàn)在 2 型糖尿病。 白介素 )是一個細(xì)胞因子 ,主要來源于巨噬細(xì)胞 , 在 1 和 2 型糖尿病中參與調(diào)節(jié)炎癥 /免疫反應(yīng)和參與抑制胰島素的生物學(xué)釋放以及胰島細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道 ,這些作用是通過激活介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子核因子 k B 產(chǎn)生的，這是鋅對胰島 B 細(xì)胞的不利因素。 四、 型糖尿病 長 6個跨膜域 ,p，編碼的蛋白為含有 369個氨基酸的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 8,它特異性的在胰島 51。 夠促進(jìn)鋅離子從細(xì)胞質(zhì)到胞內(nèi)胰島素囊泡中的聚集，然后胰島素與 2個 合形成較穩(wěn)定的六聚體儲存起來，當(dāng)胰島 此， 44。 2能與 52相關(guān)。 22 等位基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)基因， 沒有觀察 內(nèi)報(bào)道 型糖尿病患者和對照組有顯著差7 異，表明等位基因的 型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加， 53。國外研究報(bào)道 2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加 54 綜上所述， 型糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素相關(guān)， 因多態(tài)性為復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，在某些特定種族、特定家族有著較高的發(fā)病率。 本文主要討論 甘肅漢族人群 因多態(tài)性與 2型糖尿病及其相關(guān)因素的關(guān)系，以進(jìn)一步了解 甘肅 漢族人群 2 型糖尿病患者與 8 研究對象與方法 究對象 2 型糖尿病組：隨機(jī)選取甘肅漢族 2 型糖尿病患者（分別選自甘肅省人民醫(yī)院及 蘭州市第一人民醫(yī)院 ）共 116 例 (男 60 例，女 56 例， 平均年齡（ 。彼此間無血緣關(guān)系。均排除重度吸煙 (10 支 /日 )、飲酒者；排 除高血壓、冠心病、陳舊性心梗等心血管疾病以及肝、腎疾患、原發(fā)性性腺、甲狀腺、甲狀旁腺、垂體疾患及腎功能損害；排除糖尿病酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥； 2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)按照 1999 年世界衛(wèi)生組織 (定的診斷標(biāo)準(zhǔn) ， 即空腹血糖 ( 126mg/l)，和 /或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（ 2 小時血糖200mg/1 l)。 正常對照組：同期選取蘭州市第一人民醫(yī)院體檢中心漢族健康體檢者。選擇血糖正常者 80 名，其中男性 41 名，女性 39 名，平均年齡（ 。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者既往血糖正常，空腹血漿葡萄糖 且 2 小時血漿葡萄糖水平 。排除心、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病，未服用影響糖代謝的藥物并無糖尿病家族史。 究對象的臨床資料收集及人體測量 本資料 醫(yī)生按照統(tǒng)一制定的表格進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問及體格檢查。記錄一般資料如性別、年齡、病程及家族史等。由專人測量受試者 身高（ m）、體重（ 收縮壓（ 舒張壓（ 計(jì)算體重指數(shù)（ =體重 /身高 2（ kg/血壓測定：空腹?fàn)顟B(tài)下研究對象坐位休息 5鐘后測量肱動脈， 測量 2 次，取兩次均值。 腰圍測量：被測者垂直站立，雙腳分開 25米，取髂前上棘與第 12 肋骨下緣連線中點(diǎn)，水平繞腰部的周徑；臀圍測量：雙足并攏，環(huán)繞臀圍自股骨大粗隆水平進(jìn)行的周徑。 9 驗(yàn)室指標(biāo)的測量 所有研究對象禁食 10 小時以上，留取晨起肘靜脈血樣 3檬酸鉀 抗凝，置于 保存，用于提取基因組 留取 5于生化指標(biāo)檢測。 采用氧化酶法測定空腹血糖 ( 總膽固醇 (C)、甘油三酯 (高密度脂蛋白膽固醇 (低密度脂蛋白膽固醇 (采用放免法測定空腹胰島素 ( 采用穩(wěn)態(tài)模型 評價胰島素抵 抗 指數(shù)（ 和胰島 B 細(xì)胞 分泌功能指數(shù)（ ： 20 （ 血液基因組 取試劑盒（ 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司； 劑： 合酶、 10 100 .8 5 ; 500 v/v)； 25、 106上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限 公司 ）； 3. 物序列 根據(jù) 供的 基因序列應(yīng)用 和 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成），兩個 點(diǎn)引物如下。 3.1 5 3 5 3 10 3.2 5 3 5 3 限制性核 酸內(nèi)切酶 上海 ） 瓊脂糖凝膠型號 ： 購于 上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù) 有限公司 ) 電泳緩沖液 ： 10 液 (購于 上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù) 有限公司 ) 4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 應(yīng)擴(kuò)增儀 （加拿大 司）； 凈工作臺 （ 江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠 ）； 電熱恒溫水槽 （ 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 ）； 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 （ 上海琪特分析儀器有限公司 ）； 低溫高速離心機(jī)（美國 司） 臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠 613 型） 型電泳槽 （ 上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠 ）； 凝膠成像系統(tǒng) （ 司 ） ； 外 司 )； 移液器 （范圍 100l， 20l， l）（加拿大 司 ）； 冰箱（青島海爾）； 及槍頭（上海生工提供）； 11 5. 實(shí)驗(yàn)方法和步驟 液基因組 提取 在充分解凍并混勻的全血樣本中，抽取血樣 200L，采用蛋白酶 K 快速裂解消化 法（離心柱型試劑盒）提取血液基因組 體步驟如下： 取血液樣本 250L，加入 400L 細(xì)胞裂解液 倒混勻， 12000心 2去上清，留下細(xì)胞核沉淀，向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中 ， 加入 200S 振蕩至徹底混勻； 加入 10L 蛋白酶 K 溶液（ 10白酶 K 里加入 1餾水 ），混勻； 加入 200L 緩沖液 分顛倒混勻， 在 65 水箱 中 放置 10間顛倒混勻 多 次，至溶液變清亮為止； 加入 200L 無水乙醇，充分顛倒 至 混勻； 將所得溶液，加入吸附柱 （吸附 柱 入收集管中）， 120000s，倒掉收集管中的廢液， 重新 將吸附柱 入收集管中； 向吸附柱 加入 500L 緩沖液 按要求 添 加無水乙醇），12000心 90s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 新 放入收集管中； 向吸附柱 加入 500L 漂洗液 按要求 添加 無水乙醇），12000心 90s 后 ，倒掉收集管中的廢液； 向吸附柱 加入 500L 漂洗液 按要求 添加 無水乙醇），12000心 60s 后 ，倒掉收集管中的廢液； 將吸附柱 次 放回收集管中， 12000心 2 ，倒掉廢液，將吸附柱 室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干吸附材料中殘 存 的漂洗液； 將吸附柱 入干凈的離心管中，向吸附膜懸空滴加 200L 洗脫緩沖液 溫 下 放置 512000心 2 ，將溶液收集到離心管中。 制備的 品用 紫外分光光度計(jì)和 瓊脂糖凝膠電泳檢測 濃度和純度。 度、純度鑒定 判斷純度： 度采用 值進(jìn)行分析，確定比值在 純度好； 比值 能有核糖核 酸存在（ 尤其是 270 最高吸收峰的蛋白質(zhì)； 比值 明有蛋白質(zhì)污染 結(jié)果。 12 隨機(jī)選取 （ A） 11、 32、 68、 75、 101, （ B） 23、 34、 67、77、 80 十個樣本在 酸蛋白分析儀 上 測定濃度和純度，分別取波長為 260280得其相應(yīng)的 用公式： 量 =50 g/釋倍數(shù)，計(jì)算出 量；利用公式： 度 =次檢測前先用 水調(diào)零，結(jié)果 (見表 1)： 表 1 選取基因組 度、純度鑒定 樣本號 濃度（ 1） 純度（ 260/280） A 11 113 2 159 8 129 5 231 01 198 23 204 4 154 7 184 7 199 0 201 表顯示提取的基因組 度較合適 ，純度亦較好。 A 組為 2 型糖尿病組 B 組為正常對照組 的基因體外擴(kuò)增 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) - 限制性片段長度多態(tài)性 (的方法檢測待測樣本的基因型。具體步驟如下： 根據(jù) 供的 基因序列應(yīng)用 和 物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)了引物 , 兩個 點(diǎn)引物如下 。引物由 上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù) 有限公司 合成。 1. 5 3 5 3 2. 5 3 13 5 3 1)引物的稀釋 ： 根據(jù)說明書 ， 在合成好 的上游引物中加入 73L 游引物中加入 74L 使其濃度皆為 100， 再取 10L， 加 90L 釋至 10 備用。 2)應(yīng)體系的組成（總反應(yīng)體系 15L） 0(50l) (50l) 5U/) 1l 5l 3） 增循環(huán)條件： 95 5 95 30 45 72 600 30 58 30 72 400 72 6 4 ) 切體系： 14 37 ， 增產(chǎn)物的鑒定 膠電泳 凝膠的制備：電子天平稱取 3g 瓊脂糖，置于 100形瓶中，加入 100 分，微攪拌溶解，微波爐里加熱沸騰，瓊脂糖凝膠全部熔化，冷卻至 60 加入 5 1 溴化乙錠 (存液，搖勻，配制成 3%瓊脂糖凝膠溶液。 膠板的準(zhǔn)備：在膠槽內(nèi)插入梳子，將錐形瓶內(nèi)的瓊脂糖 凝膠冷卻到 60 左右，將凝膠緩慢倒入膠槽中，形成均勻的膠層。凝固后將膠槽靜置于水平支持物上，待膠完全凝固后，將膠槽放入電泳槽，加入 沖液至液面恰好蓋過膠板上表面，然后撥出梳子。 加樣：取酶切產(chǎn)物 5 1、 1 上樣于 3%瓊脂糖凝膠 加樣孔中 ；把樣品與 51 100入凝膠板的樣品孔中作為參照物。 電泳：接通電源，電壓 150V， 30 分鐘后停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于成像系統(tǒng)儀器，照相，并根 據(jù)酶切圖譜判斷基因型。 因型的判定 因 的 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，切開片段長度分別為 332 231101果 T/T:332 1 條帶， C/C:231101 條帶， C/T:332231101 3 條帶； 如圖一所示。 點(diǎn)含 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，切開片段長度分別為 3192254結(jié)果 A/A:319 1條帶 G/G:22594 2條帶 A/G:3192254 3條帶 ； 如圖二所示。 0l 10 (10U/l) 5l 15 圖片（一） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ： 1 8 為隨機(jī)樣本（ 及正常組）酶切后的產(chǎn)物，基因型分別依次為： C/C、 C/C、 T/T、 T/T、 C/C、 C/T、 T/T、 C/T。 9： 圖片（二） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ： 1 8 為隨機(jī)樣本 （ 及正常組 ） 酶切后的產(chǎn)物 ， 基因型分別依次為 ： A/G 、 G/G 、 G/G A/A、 G/G、 G/G、 A/A、 G/G。 9： 采用 計(jì) 學(xué)軟件分析。對所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的資料以 x示，非正態(tài)分布資料 (對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)后進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料間比較用 驗(yàn) ， 的年齡顯著高于 但 的 腰臀比，顯著高于 (分別為 05) 表 2 不同代謝人群一般臨床與生化指標(biāo)比較 （ n=80） （ n=116） P 年齡（歲） 別（男 /女） 41/39 60/56 重（ MI(kg/C（ 臀比 BP(BP(C() G() ) ) ) PG() 7 ） 注：年齡、 非正態(tài)，非正態(tài)分布資料，數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布資料，最后數(shù)據(jù)以 x示。 不同糖代謝組間 因型頻率和等位基因頻率比較 因 因型頻率在 的分布符合 衡（ P 如表 2 所示， 因 基因型 因型頻率明顯