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雞 的 切 片 制 作實 驗報告 實驗三 病變組織的取材、固定和修塊一.實驗?zāi)康恼莆沼糜诓±斫M織學(xué)診斷的組織材料的取材原則，固定方法及修塊標準。二實驗耗材手術(shù)刀、組織剪、刀片、生理鹽水、多聚甲醛固定液（福爾馬林）、鉛筆等。三實驗過程1.取材：用頸部放血法處死公雞，打開腹腔，取需要的組織。切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mm*5mm*2mm或10mm*10mm*2mm為宜。取下所需的組織，切成一小塊2-3mm厚。注意：取材動作要迅速。不宜做太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化，不要損傷所需要的部分。2. 固定：將切好的內(nèi)臟組織用 生理鹽水把組織洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定。（固定的作用）組織經(jīng)一系列的處理后，就必須進行固定。固定的作用，從組織學(xué)的角度其簡單的定義是，保持細胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，使之盡量保持細胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而從免疫組化技術(shù)的角度，固定的作用不僅是使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，盡量減少或終止外源性酶和內(nèi)源性酶的反應(yīng)；防止細胞的自溶，以免使抗原擴散至組織間質(zhì)；以保持組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；更重要的是保持組織或細胞的抗原性，不但要使抗原不導(dǎo)致失活，而且不使抗原發(fā)生彌散的現(xiàn)象，才能在免疫組化染色時，不產(chǎn)生過深的背景，影響對陽性物的判斷。3. 修塊樣品要求：長，寬各1cm左右，厚不宜超過1cm（依據(jù)組織不同要求不同）。肝、腎、脾、肺、肌肉、消化道、腦其他注意（1）組織固定越新鮮越好。組織一經(jīng)離體，就能及時地固定，這是最好的。（2）固定材料時，固定液必須充足，一般材料塊的20-30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1-2次新液。（3）組織固定，組織塊不宜過大。對于產(chǎn)酶類的器官如肝、腎、脾等，更要處理好，否則更容易出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。（4）對不同類型的組織應(yīng)適當合理地選擇固定液。（5）組織固定，時間不宜太短，也不宜太長。（6）特殊病例或特殊物質(zhì)應(yīng)選擇特殊的固定液。一般的病例標本，如沒特殊的要求，都可以應(yīng)用甲醛配成的各種固定液來固定。但是，如果要顯示狂犬病毒的包含體時，應(yīng)用上述的的固定液就不行了，必須采用丙酮來固定，顯示糖元，可選擇無水酒精或丙酮來固定組織。（7）有些混合固定液的成分之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才能混合，如果混合太早，固定就沒作用了。如Zenker液（一種核固定劑），最適合于造血和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的固定。實驗四 組織的脫水處理一實驗?zāi)康恼莆战M織脫水的目的和原理，及在實驗過程中的注意事項。二實驗耗材75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精。三、實驗步驟原理： 用脫水劑完全除去組織內(nèi)的水分，為下一步透明及浸蠟創(chuàng)造條件。此外，脫水還可以使組織再次發(fā)生一定的硬化，脫水劑必須是與水在任何比例下均能混合的液體。脫水概念：把含于組織內(nèi)或細胞內(nèi)的水份用脫水劑把其置換出來的過程稱組織脫水。（脫水過程）1、水洗：將固定組織塊放入廣口瓶，瓶口用紗布包好，置流水下水洗，水洗時間依固定時間而定，一般12h以上，固定時間越長水洗時間越長。2、脫水1）75%酒精 12h2) 85%酒精 6-8h3）95%酒精 12h4) 100%酒精 2h5) 100%酒精 2h組織塊在進入下一階段梯度酒精前要用吸水紙吸干水，尤其在95%酒精中進入100%酒精（）中，切記防止帶入水分，所有過程要在瓶口加蓋，防止水分子進入。（脫水的基本原則）從低濃度酒精開始逐漸升到高濃度酒精，以保持組織中的水分完全脫凈。一般1cmX1cmX0.2cm大小的組織,脫水全過程僅需要數(shù)小時即可達到完全脫水。在各級濃度酒精內(nèi)處理的最短時間分別減少到24小時也能獲得滿意的結(jié)果。但是有時為了某種特殊要求，例如要做糖元的切片標本或是要做尿酸結(jié)晶染色切片標本，為了防止糖元和尿酸結(jié)晶在水中消失卻要直接投入無水酒精中固定，而不需要經(jīng)過水洗和低濃度酒精的脫水過程。經(jīng)無水酒精固定后的組織只需要再經(jīng)過換一次無水酒精脫水即可。注意事項： （1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。 （3）在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。 （4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。（5）如需過夜，應(yīng)停留在80%酒精中。 （6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。實驗五 組織的透明、浸蠟和包埋一實驗?zāi)康牧私馔该?、浸蠟原理，掌握透明、浸蠟和包埋的方法。二實驗材料二甲苯、西林瓶、二甲苯：石?1:1、石蠟、烘箱、包埋框、標簽紙、鉛筆等。3 實驗過程1. 透明透明主要是萃取可溶性有機物質(zhì)。由于乙醇和石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過度。先用二甲苯浸泡1.5-2小時，然后在放入二甲苯中浸泡，同時觀察透明程度。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同的透明狀態(tài)后可立即取出，浸泡過久的組織則會變脆。2. 浸蠟將處理好的材料置于1:1石蠟二甲苯混合物2.5h，再放入石蠟30min。浸蠟的目的是除去組織中的透明劑，使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度，以便包埋。浸蠟時間根據(jù)組織大小而定。浸蠟應(yīng)在恒溫箱中進行，溫度保持在55-60左右，溫度過高會使組織發(fā)脆。3. 包埋和修塊將60的純蠟迅速倒入包埋盒內(nèi)，再迅速將浸蠟后的組織放入，一定要注意將平整的組織切面朝下，并將標簽一同放入包埋盒，待石蠟全部凝固后取出。整個過程要迅速，防止蠟?zāi)踢^快，或組織傾斜，不利于切片。將包埋好的組織蠟塊進行修整，削去組織周圍的蠟塊，整體與木塊大小相適應(yīng)，將標簽貼在蠟塊側(cè)面，用灼燒過的刀片將標簽微嵌入蠟塊中，以便于切片。實驗六 組織切片技術(shù)1 實驗?zāi)康氖煜で衅瑱C的使用方法，掌握切片厚度，撈片技巧，烘片溫度的控制及時間等。2 實驗器材切片機、蠟塊、毛筆、刀片、鑷子、烘箱、水浴鍋、載玻片、蛋白甘油等。3、 實驗過程1. 切片 將組織蠟塊裝在切片機的夾物臺上，將切片刀安裝在刀夾上。搖動螺旋使蠟塊貼近刀片，調(diào)整蠟塊和刀口的角度與位置，調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為5微米。在正式切片前先微修，以約20微米切去組織前的石蠟，直至組織切面露出為止。切片時右手轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，約有3-4片組成。左手持毛筆將蠟帶提起，并牽引成帶，放在水浴鍋中（34恒溫）。當組織在水面上展平后，進行撈片。2. 撈片將載玻片提前抹好適量蛋白甘油，確保組織完全貼附在載玻片上，在組織一側(cè)，將載玻片垂直插入水中，用鑷子輕輕撥動組織，使組織靠近載玻片，并成功貼附在上面，并對其進行標記，放入45烘箱中烘片。注意事項取清潔的載玻片，滴粘片劑于玻片中央，用洗凈的手指抹勻。滴12滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。用小鑷子輔助，將在水中展平的蠟片撈至玻片上，并粘貼標簽。將玻片置于預(yù)先加熱的展片臺上（溫度保持在4045），使蠟片因受熱而伸展攤平。展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于45溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。實驗七 HE染片的制作一實驗?zāi)康氖炀氄莆誋E染色步驟及染色原理。二實驗材料二甲苯、二甲苯、100%酒精、100%酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、蘇木素、伊紅、鹽酸酒精、氨水、染色架、燒杯、光學(xué)顯微鏡等。3 實驗過程（1） 脫蠟1 二甲苯 （脫蠟） 15min2 二甲苯 （脫蠟） 15min3 100%酒精 （脫二甲苯） 7min4 100%酒精 （脫二甲苯） 6min5 95%酒精 （脫二甲苯） 5min6 85%酒精 （脫二甲苯） 4min7 75%酒精 （脫二甲苯） 3min8 自來水或蒸餾水洗（去酒精） 5min（二）染色9 蘇木素染液 23min10 沖洗 清水（藍化）15min11 鹽酸酒精酸化 視情況而定 5-10s12 氨水 視情況而定 5-10s13 沖洗 淡藍色即可 20min14 伊紅染液 視情況而定 1min（三）脫水，透明15 75%酒精 顏色淡化2-3s16 85%酒精 2-3s17 95%酒精 2-3s18 100%酒精 2min19 100%酒精 5min20 烘箱烘干21 二甲苯 （透明） 5min22 二甲苯 （透明） 15min23 封藏 中性樹膠24 烘干 烘箱注意事項：1、脫蠟復(fù)水染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復(fù)水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。2、染色染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。3、水洗沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍（或放入堿性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應(yīng)以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。4、分化 將細胞質(zhì)著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關(guān)鍵，如分化不當會導(dǎo)致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。5、 漂洗 切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結(jié)構(gòu)清楚；細胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標準。然后放入蒸餾水中漂洗一次。6、復(fù)染 伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。7、封藏：中性樹膠封存 切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。實驗八 病理組織學(xué)診斷及照相一實驗?zāi)康耐ㄟ^在顯微鏡下觀察，了解各種組織器官的組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，并使用數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)對典型病變拍照。二實驗材料光學(xué)顯微鏡、組織切片、擦鏡紙等。3. 實驗內(nèi)容1、 用學(xué)生用Olympus顯微鏡觀察各組織的病理組