《基因工程的基本操作程序》

.,原核細胞的基因結(jié)構(gòu)(補充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達,上游有啟動子，下游有終止子,啟動子,.,真核細胞的基因結(jié)構(gòu)（補充內(nèi)容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶結(jié)合位點,內(nèi)含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,.,原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,.,基因工程的基本操作程序,.,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,.,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、獲取目的基因的常用方法,（1）從基因文庫中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴增,（3）人工合成,例如：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、植物抗病基因等,.,1、從基因文庫中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,.,.,某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,基因組文庫的構(gòu)建,基因組文庫,某種生物某個時期的mRNA,cDNA,受體菌群體,部分基因文庫（cDNA文庫）,cDNA文庫的構(gòu)建,基因組文庫和部分基因文庫比較,.,（3）如何從基因文庫中得到所需要的基因？,依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。,如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。,.,（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因,PCR多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)使其數(shù)量呈指數(shù)方式增加，可獲取大量的目的基因。,.,PCR技術(shù),原理：前提：原料：方式,DNA復(fù)制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式擴增，即_（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）,指數(shù),2n,一段已知目的基因的核苷酸序列（DNA模板）引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）,.,過程：,“變性、退火、延伸”三步曲,變性：加熱至9095雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至5560部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至7075以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈,.,逆轉(zhuǎn)錄法,目的基因的信使RNA,雙鏈DNA（目的基因),化學(xué)合成法,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,人工合成,逆轉(zhuǎn)錄酶,3、人工合成目的基因,推測,推測,單鏈DNA,DNA聚合酶,.,1、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴增目的基因反轉(zhuǎn)錄法通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成ABCD,D,.,3、目的基因主要是指_的結(jié)構(gòu)基因。獲得目的基因的常見方法有三種：（1）從基因文庫中獲取目的基因，根據(jù)基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_產(chǎn)物mRNA，基因的_產(chǎn)物蛋白質(zhì)等獲取目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因，該技術(shù)是一項在_完成的核酸合成技術(shù)，前提條件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因較小且核苷酸序列已知，可以通過_方法。,編碼蛋白質(zhì),核苷酸,染色體,轉(zhuǎn)錄,表達,體外,核苷酸,引物,人工合成,.,a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用,思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,二、基因表達載體的構(gòu)建核心,.,不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,2、基因表達載體的組成：,目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因,它們各自的作用是什么?,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,.,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_。（2）用_切斷目的基因，使其產(chǎn)生_。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,1.過程:,.,1、下列關(guān)于基因表達載體的敘述不正確的是A啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼子B啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C標(biāo)記基因是為了鑒別受體細胞中是否有目的基因從而便于篩選D基因表達載體的構(gòu)建視受體細胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別,A,2、目前轉(zhuǎn)基因工程可以A.打破地理隔離但不能突破生殖隔離B.打破生殖隔離但不能突破地理隔離C.完全突破地理隔離和生殖隔離D.部分突破地理隔離和生殖隔離,C,.,(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞,常用的受體細胞：,動植物細胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌等。,將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,轉(zhuǎn)化,目的基因進入_內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,2020/4/26,24,.,方法,導(dǎo)入植物細胞,導(dǎo)入動物細胞,導(dǎo)入微生物細胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞吸收DNA分子,(三)將目的基因?qū)胧荏w細胞,25,.,1、將目的基因?qū)胫参锛毎?（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,特點:,能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力,Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上,轉(zhuǎn)化過程:,Ti質(zhì)粒目的基因,構(gòu)建,表達載體,植物細胞,植物細胞染色DNA,新性狀,農(nóng)桿菌,.,（2）基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。,.,（3）花粉通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。,.,2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法程序：,目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物,.,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?常用法：Ca2+處理,常用菌：大腸桿菌,微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少,過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài)細胞,表達載體與感受態(tài)細胞混合,感受態(tài)細胞吸收DNA,.,1、基因工程中科學(xué)家常用細菌、酵母菌等微生物作為受體細胞，原因是A結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B繁殖速度快C遺傳物質(zhì)含量少、簡單D性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細胞有大腸桿菌枯草桿菌支原體動植物細胞ABCD,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細胞D.目的基因的檢測和表達,C,.,4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列與細菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細菌感染棉的體細胞，再進行組織培養(yǎng)ABCD,C,5.下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管道法顯微注射法胚胎移植DNA分子雜交法ABCD,C,.,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢測,導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細胞,方法,DNA分子雜交,表達檢測,轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交,翻譯檢測抗原抗體雜交,分子檢測法,鑒定,抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等,個體水平的鑒定,.,知識延伸DNA分子雜交技術(shù),該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,.,返回,.,1、用-珠蛋白的DNA探針可以檢測出的遺傳病是A鐮刀狀細胞貧血癥B白血病C壞血病D苯丙酮尿癥,A,2、應(yīng)用基因工程技術(shù)診斷疾病的過程中必須使用基因探針才能達到檢測疾病的目的。這里的基因探針是A用于檢測疾病的醫(yī)療器械B用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子C合成-珠蛋白的DNAD合成苯丙羥化酶的DNA片段,B,.,思考與探究：,2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,.,4.-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進行設(shè)計？,（1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA)。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。（3）將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已進入其中。（4）培養(yǎng)進入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取-珠蛋白。,.,復(fù)習(xí)題,1）將目的基因?qū)胧荏w細胞有哪些方法?(試舉例說明),2）簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,.,4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,.,1、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫,C,.,5）基因工程是在DNA分子水平上