動(dòng)物肝臟中DNA的提取及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

動(dòng)物肝臟中DNA的提取及檢測(cè)一、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸（DNA，為英文Deoxyribonucleicacid的縮寫(xiě)），又稱去氧核糖核酸，是脫氧核糖核酸染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是組成基因的材料。有時(shí)也被稱為“遺傳微?！?，原因是在繁殖過(guò)程中，父代會(huì)把它們自己DNA的一部分復(fù)制傳遞到子代中，從而完成性狀的傳播。DNA是高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。DNA對(duì)紫外線（260nm）有吸收作用，利用這一特性，可以對(duì)DNA進(jìn)行含量測(cè)定。當(dāng)核酸變性時(shí)，吸光度升高，稱為增色效應(yīng)；當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時(shí)，吸光度又會(huì)恢復(fù)到原來(lái)的水平。較高溫度、有機(jī)溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子變性，即DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)也稱為DNA的解螺旋。在細(xì)胞內(nèi)，DNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱為染色體組。對(duì)于人類而言，正常的體細(xì)中含有46條染色體。染色體在細(xì)胞分裂之前會(huì)先在分裂間期完成復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃分為：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。對(duì)于真核生物，如動(dòng)物、植物及真菌而言，染色體主要存在于細(xì)胞核內(nèi)；而對(duì)于原核生物，如細(xì)菌而言，則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的擬核內(nèi)。染色體上的染色質(zhì)蛋白，如組織蛋白，能夠?qū)NA進(jìn)行組織并壓縮，以幫助DNA與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行交互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)DNA的結(jié)構(gòu)： DNA的結(jié)構(gòu)一般可劃分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)四個(gè)水平。DNA是一種長(zhǎng)鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即腺嘌呤脫氧核苷酸（dAMP 脫氧腺苷）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（dTMP 脫氧胸苷）、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP 脫氧胞苷）、鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（dGMP 脫氧鳥(niǎo)苷）。而脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長(zhǎng)鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。讀取密碼的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄，是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱為mRNA（信使RNA）的核酸分子。DNA是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用3， 5-磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長(zhǎng)鏈。大多數(shù)DNA含有兩條這樣的長(zhǎng)鏈，也有的DNA為單鏈，如大腸桿菌噬菌體X174、G4、M13等。DNA有環(huán)形DNA和鏈狀DNA之分。在某些類型的DNA中，5-甲基胞嘧啶可在一定限度內(nèi)取代胞嘧啶，其中小麥胚DNA的5-甲基胞嘧啶特別豐富。在某些噬菌體中，5-羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期，查加夫（E.Chargaff）發(fā)現(xiàn)不同物種DNA的堿基組成不同，但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸腺嘧啶數(shù)（A=T），鳥(niǎo)嘌呤數(shù)等于胞嘧啶數(shù)（G=C），因而嘌呤數(shù)之和等于嘧啶數(shù)之和，一般用幾個(gè)層次描繪DNA的結(jié)構(gòu)。濃鹽法從動(dòng)物組織中提取DNA核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高濃度鹽溶液，但在0.14 M的鹽溶液中溶解度很低，而RNP則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的NaCl溶液將其從樣品中分別抽提出來(lái)。將抽提得到的DNP用SDS處理可將其分離DNA和蛋白質(zhì)，用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。肝臟細(xì)胞肝臟是由肝細(xì)胞組成，肝細(xì)胞極小，肉眼看不到，必須通過(guò)顯微鏡才能看到。人肝約有25億個(gè)肝細(xì)胞，5000個(gè)肝細(xì)胞組成一個(gè)肝小葉，因此人肝的肝小葉總數(shù)約有50萬(wàn)個(gè)。肝細(xì)胞為多角形，直徑約為20-30/加(微米)，有6-8個(gè)面，不同的生理?xiàng)l件下大小有差異，如饑餓時(shí)肝細(xì)胞體積變大。每個(gè)肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含有許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu):如肝細(xì)胞核、肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握濃鹽法從動(dòng)物組織中提取DNA的原理與技術(shù)三、實(shí)驗(yàn)原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/RNP）的形式存在，其中DNP能溶于水及高濃度鹽溶液，但在0.14 M的鹽溶液中溶解度很低，而RNP則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的NaCl溶液將其從樣品中分別抽提出來(lái)。將抽提得到的DNP用SDS處理可將其分離DNA和蛋白質(zhì)，用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。四、實(shí)驗(yàn)器材和材料試劑實(shí)驗(yàn)器材： 勻漿器 量筒 離心機(jī) 離心管 試管 吸管 恒溫水浴鍋實(shí)驗(yàn)材料： 豬肝實(shí)驗(yàn)試劑： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 檸檬酸鈉溶液（pH6.8） 95%乙醇（A.R.） NaCl固體（A.R.） 5%SDS溶液（5g SDS 定容至100ml） V(氯仿)：V（異戊醇）20：1的混合液五、實(shí)驗(yàn)操作1.稱量稱取一定質(zhì)量的豬肝，加入2倍肝重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎（已完成）。2.提取DNA量取肝糜4 ml 于10毫升離心管，在4000r/min下離心10min ，沉淀中再加入8 ml緩沖液于4000r/min離心5 min；棄上清，取沉淀；將沉淀用10 ml檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入5 ml 氯仿-異戊醇混合液、1 ml SDS，振蕩30min（保鮮膜封口）；緩慢加入固體NaCl（約0.9g），使其最終濃度為1mol/L；將溶液分裝到2個(gè)10毫升離心管中，在4000r/min離心5 min，取上清水相；在上述水相溶液中分別加等體積冷95%乙醇，邊加邊用玻棒慢慢朝一個(gè)方向攪動(dòng)，將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得DNA粗品；用8ml蒸餾水溶解DNA粗品于10ml離心管中。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表加入各種 試劑，混勻，于60恒溫水浴鍋45min，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下于分光光度計(jì)比色測(cè)定，以吸光度對(duì)DNA濃度作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm4.樣品的測(cè)定將DNA粗品定容至25ml容量瓶，再取DNA樣液1.0ml，加入蒸餾水1.0ml，混勻。然后準(zhǔn)確加入二苯胺試劑4.0ml，混勻，于60恒溫水浴鍋45min，冷卻后，595nm波長(zhǎng)下于分光光度計(jì)比色測(cè)定，根據(jù)所測(cè)的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得DNA的質(zhì)量（ug）。5.計(jì)算100g豬肝中DNA含量w=m1/m2100%w：DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）m1：樣液中測(cè)得的DNA的質(zhì)量（ug）m2：樣液中所含樣品的質(zhì)量（ug）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液/ml0.00.40.81.21.62.0蒸餾水/ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA含量/ug0801602403204002.實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理豬肝質(zhì)量為2.04gDNA提取液體積為12.53ml序號(hào)123A595nm0.1020.1020.101平均A595nm0.102樣液中DNA含量/ug171.4樣液中樣品質(zhì)量/g0.1628根據(jù)公式w=m1/m2100%得：w=0.1053則100g豬肝中DNA含量為：w100=0.1053g七、思考題1.實(shí)驗(yàn)中的乙醇、SDS、氯仿-異戊醇、NaCl、檸檬酸鈉分別有什么作用？答：檸檬酸的鈉鹽在實(shí)驗(yàn)中既充當(dāng)DNA酶的抑制劑，也是pH緩沖溶液；SDS是表面活性劑，可以讓蛋白質(zhì)與DNA分開(kāi)；氯仿是有機(jī)溶劑，可以使蛋白質(zhì)聚集沉淀，便于分離出去；異戊醇是消泡劑，可以減少泡沫的發(fā)生；氯仿-異戊醇的作用是使蛋白質(zhì)變性、膜溶解；NaCl固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液，在這樣的環(huán)境中DNA核蛋白能溶解，RNA核蛋白則溶解度很低，可以利用這一性質(zhì)分離兩種核酸。八、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.DNA主要集中在細(xì)胞核中，因此，通常選用細(xì)胞核含量比例大的生活組織作為提取制備DNA的材料，小牛胸腺組織中細(xì)胞核比例較大，因而DNA含量豐富，同時(shí)其脫氧核苷酸酶活性較低，制備過(guò)程中DNA被降解的可能性相對(duì)較低，所以是制備DNA的良好材料，但其來(lái)源較困難，脾臟或肝臟易獲得，也是實(shí)驗(yàn)室制備DNA常用的材料，本實(shí)驗(yàn)用新鮮肝臟作為實(shí)驗(yàn)材料。2.為了防止大分子核酸在提取過(guò)程中被降解，須采取以下措施：整個(gè)過(guò)程必須在低溫下進(jìn)行，可加入某些物質(zhì)抑制核酸酶的活性，如檸檬酸鈉、EDTA、SDS等，EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制劑。3.從核蛋白中脫去蛋白質(zhì)的方法很多，經(jīng)常采用的有：氯仿-異丙醇法、苯酚法、去垢劑法等，他們均能使蛋白質(zhì)變性和核蛋白解聚，并釋放出核酸。4.使用離心機(jī)時(shí)，對(duì)稱放置的離心管必須用天平調(diào)平衡。5.避免劇烈振蕩，如研磨過(guò)程、攪拌過(guò)程等。九、實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差分析及討論經(jīng)過(guò)對(duì)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出100g豬肝中DNA含量大約為0.1053g的結(jié)論，在上網(wǎng)查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)：豬肝中DNA含量與本次試驗(yàn)實(shí)際操作測(cè)量得出的結(jié)果大致相互吻合。由此可知，本次試驗(yàn)結(jié)果是相對(duì)比較成功的，較為粗略地測(cè)量出豬肝中DNA的含量，并且較為熟練地掌握了濃鹽法從動(dòng)物組織中提取DNA的原理與技術(shù)，基本達(dá)到了本次實(shí)驗(yàn)的目的。但是本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是粗略測(cè)量，并未達(dá)到精確測(cè)量豬肝中DNA的含量，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較理論值偏低，這是由于某些誤差導(dǎo)致，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中些許因素可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)有偏差，經(jīng)分析得出以下幾點(diǎn)：在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行研磨的過(guò)程中，由于豬肝組織表面較滑不易磨碎，且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘留，因此可能導(dǎo)致豬肝中DNA提取不充分，致使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較理論值偏低；研磨過(guò)程中，可能由于操作不當(dāng)，導(dǎo)致部分液體濺出，因此可能使得提取液中部分DNA損失，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏低；在粗提取DNA操作中，頻繁地將DNA提取液轉(zhuǎn)移至各個(gè)儀器內(nèi)，可能有極小部分DNA提取液未倒凈，殘留在儀器壁上損耗掉，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差；在使用移液槍的過(guò)程中，可能因?yàn)椴僮鞑划?dāng)或移液槍經(jīng)常錯(cuò)誤使用，出現(xiàn)儀器誤差，導(dǎo)致吸取的DNA樣液不精確，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)誤差；在水相中加入乙醇析出DNA時(shí)，不是