第六章：常用分子生物學(xué)技術(shù)——RNA干擾技術(shù)ppt課件

.,藥學(xué)分子生物學(xué),張徐江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)及檢驗(yàn)教研室,xuzhang,.,生物芯片（biochip）,以生物、電子、機(jī)械和信息技術(shù)為基礎(chǔ)，在固相支持物表面建立集成、連續(xù)、微型分析系統(tǒng)，形成芯片，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子的準(zhǔn)確、快速、高通量、自動(dòng)化檢測(cè)。,.,基因芯片（genechip）,將大量探針有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探針，然后與標(biāo)記的待測(cè)核酸樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)探針雜交信號(hào)強(qiáng)度的分析來(lái)獲知樣品中相應(yīng)靶分子的數(shù)量和序列信息。,.,基因芯片工作原理：核酸分子雜交,1.芯片的制備,基因芯片檢測(cè)步驟：,2.樣品準(zhǔn)備和標(biāo)記,3.分子雜交,4.信號(hào)檢測(cè),5.數(shù)據(jù)處理分析,.,蛋白質(zhì)芯片（proteinchip）,將蛋白質(zhì)有序固定于載體上制備芯片，然后用標(biāo)記的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，洗去未結(jié)合的成分，再檢測(cè)芯片上的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白質(zhì)間或蛋白質(zhì)與其他分子之間的相互作用關(guān)系。,.,將不同生物體組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在固相載體上形成的組織微陣列，是一種高通量、多樣本的分析工具。,組織芯片（tissuemicroarray）,.,用人工方法測(cè)定并分析核酸的堿基組成及排列順序，即測(cè)定核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。第一代測(cè)序技術(shù)：鏈末端終止法(Sanger法，雙脫氧鏈終止法),核酸測(cè)序（sequencingofnucleicacids）,.,雙脫氧鏈終止法測(cè)序,以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，DNA聚合酶介導(dǎo)體外合成互補(bǔ)DNA。雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP）為鏈終止子（4組1套反應(yīng)），合成四組有序列梯度的互補(bǔ)DNA。高分辨電泳分離新合成DNA，根據(jù)產(chǎn)物大小識(shí)讀堿基排列順序，最終轉(zhuǎn)換為待測(cè)模板的核酸序列。,基本原理,.,雙脫氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP),.,測(cè)序模板序列,5TCAGCTCGAATC,.,第六章常用分子生物學(xué)技術(shù),第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)第二節(jié)分子雜交技術(shù)第三節(jié)基因敲除技術(shù)第四節(jié)RNA干擾技術(shù)第五節(jié)基因組編輯技術(shù)第六節(jié)分子相互作用技術(shù),.,RNA干擾技術(shù),雙鏈RNA能高效、特異性地誘導(dǎo)同源mRNA降解，從而沉默基因表達(dá)，稱(chēng)為RNA干擾（RNAinterference,RNAi），也稱(chēng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。,1990年，在轉(zhuǎn)基因牽?；ㄖ杏^察到共抑制現(xiàn)象,.,RNA干擾（RNAinterference,RNAi）,1998年，AndrewFire和CraigMelo首次將正義鏈和反義鏈RNA混合后，注入線蟲(chóng)（C.elegans），觀察到更強(qiáng)的基因表達(dá)抑制作用，據(jù)此提出RNA干擾的概念。,A.未染色組;B.正常對(duì)照組C.反義RNA組;D.正義+反義RNA組,.,2001年，首次報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過(guò)21個(gè)核苷酸大小的siRNA誘導(dǎo)特異性基因沉默。,.,安德魯菲爾&克雷格梅洛發(fā)現(xiàn)“RNA干擾機(jī)制”，獲2006年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),.,RNA干擾的機(jī)制,（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）（2）RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成（3）RISC活化：siRNA解旋成為單鏈，無(wú)活性的RISC轉(zhuǎn)變成活性形式（包含siRNA反義鏈）（4）誘導(dǎo)靶mRNA降解：在siRNA反義鏈引導(dǎo)下，RISC識(shí)別并切割與siRNA反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA（5）dsRNA的再生成,.,RNA干擾的機(jī)制,.,siRNA（小干擾RNA）：21-23nt，由dsRNA裂解而成的小片段，可誘導(dǎo)mRNA降解。siRNA主要參與抵御外源性病毒核酸的侵染。,RNA干擾（RNAinterference,RNAi）,miRNA（微小RNA）：約22nt，由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。miRNA主要參與內(nèi)源性基因表達(dá)調(diào)節(jié)。,.,.,.,RNA干擾技術(shù)實(shí)施策略,1、體外合成siRNA,采用化學(xué)合成法來(lái)直接合成靶向目的基因的siRNA，再通過(guò)不同方法導(dǎo)入細(xì)胞。,2、siRNA表達(dá)載體介導(dǎo),根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)DNA片段，插入表達(dá)載體中，導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出shRNA，進(jìn)一步切割形成siRNA。,.,體外合成siRNA,.,短發(fā)卡RNA（shRNA）,siRNA表達(dá)載體介導(dǎo),正義鏈,反義鏈,-CUGAGGUCACCAUUAGAUG-,靶mRNA,.,RNA干擾技術(shù)特點(diǎn),1、RNA干擾技術(shù)優(yōu)點(diǎn),（1）具有較高特異性（2）基因沉默效率較高,2、RNA干擾技術(shù)缺點(diǎn),“脫靶效應(yīng)”（off-targeteffects）,.,RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用,2、基因治療（基因失活性治療）,（1）病毒感染性疾病通過(guò)RNAi抑制RNA病毒復(fù)制,1、基因功能研究（功能失活策略）,（2）基因過(guò)表達(dá)引起的疾?。ㄈ缒[瘤）siRNA藥物,“基因敲減（knockdown）”,.,.,基因打靶（genetargeting）,利用同源重組原理對(duì)細(xì)胞特定內(nèi)源基因進(jìn)行改造的技術(shù)。,.,.,基因敲除（geneknockout）：宿主基因組中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，從而使靶基因失活。,基因敲入（geneknockin）：外源功能基因與宿主基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，從而在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)。,基因打靶（genetargeting）,.,基因敲除小鼠的產(chǎn)生,1.體外構(gòu)建基因敲除載體：靶基因同源DNA序列+選擇性標(biāo)記基因,2.將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：顯微注射法、電穿孔法等,3.篩選、鑒定發(fā)生了同源重組的ES細(xì)胞：標(biāo)記篩選法、分子鑒定法,4.將ES細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宮,5.小鼠交配傳代獲得特定的純合基因型子代小鼠,.,Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出現(xiàn)明顯體重增加現(xiàn)象,.,REG基因敲除鼠（下圖）出現(xiàn)脊椎彎曲等早衰現(xiàn)象,.,Gab1基因敲除導(dǎo)致小鼠缺血性血管新生、側(cè)枝循環(huán)建立出現(xiàn)缺陷（圖示上半部分），主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成的信號(hào)調(diào)控通路出現(xiàn)障礙而引起的（圖示下半部分）。,.,酪氨酸酶基因敲除后，本來(lái)是黑色的小豬，變成了白色，表現(xiàn)出典型的白化病特征。,.,基因編輯（geneediting）,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。,CRISPR/Cas系統(tǒng)：由CRISPR基因座與其串聯(lián)的Cas基因組成，通過(guò)序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解DNA。,.,Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/Ca