體內(nèi)藥物分析教程

第一部分 概述體內(nèi)藥物分析是對(duì)體內(nèi)樣本（包括生物體液、器官或組織）中的藥物、代謝物或內(nèi)源性物質(zhì)的定量分析。體內(nèi)藥物分析是藥代動(dòng)力學(xué)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）的重要手段。藥物在臨床前研究階段，首先在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)和毒代動(dòng)力學(xué)研究；在臨床研究階段，要對(duì)藥物作用于人體的安全性與有效性作出評(píng)價(jià)。這些研究中，建立有效的體內(nèi)藥物分析方法是首要任務(wù)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化治療成為新的理念。TDM就是采用靈敏可靠的方法，檢測(cè)患者體內(nèi)的藥物濃度，指導(dǎo)個(gè)體化用藥方案的制定，保證用藥的有效性與安全性。另外，監(jiān)測(cè)和研究體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的濃度變化，對(duì)于某些疾病的診斷及治療具有重要意義；對(duì)于麻醉藥品和精神藥品濫用的檢測(cè)和運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)違禁藥物的監(jiān)測(cè)，也必須依據(jù)體內(nèi)藥物分析手段和技術(shù)才能完成。藥物產(chǎn)生藥理作用的強(qiáng)度與其在體內(nèi)作用部位（受體組織）的濃度直接相關(guān)，而藥物在體內(nèi)主要依靠血液輸送至作用部位，因此血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的表觀指標(biāo)，即血液是體內(nèi)藥物分析的主要樣品。另外，尿液、唾液、頭發(fā)和臟器組織等也可作為體內(nèi)樣品。藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性，它們?cè)隗w內(nèi)的變化規(guī)律對(duì)母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評(píng)價(jià)極為重要；機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過(guò)程，其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。所以，體內(nèi)特定藥物代謝物和機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)也是體內(nèi)藥物分析的目標(biāo)。在測(cè)定體內(nèi)藥物及其特定代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)時(shí)，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后可直接測(cè)定外，通常在測(cè)定之前要對(duì)體內(nèi)樣品進(jìn)行分離凈化與濃集等樣品前處理，從而為體內(nèi)樣品中藥物的測(cè)定提供良好的環(huán)境與條件。體內(nèi)樣品大都具有以下性質(zhì)特點(diǎn)：采樣量少，采樣量一般為數(shù)毫升至數(shù)十微升，且在特定條件下采集，不易重新獲得。待測(cè)物濃度低，通常在10-910-6g/ml級(jí)，甚至低至10-12g/ml。干擾物質(zhì)多，血樣中含有蛋白質(zhì)、脂肪、尿素等有機(jī)物和Na+、K+等大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)通常對(duì)測(cè)定構(gòu)成干擾；且體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)可與藥物結(jié)合，也能干擾測(cè)定。因此，體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)是：體內(nèi)樣品需經(jīng)分離與濃集，或經(jīng)適當(dāng)?shù)奶幚砗蟛拍苓M(jìn)行分析；對(duì)分析方法的靈敏度及專屬性要求較高；分析工作量大，測(cè)定數(shù)據(jù)的處理和結(jié)果的闡明繁瑣費(fèi)時(shí)。生物樣本中所含藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度大多較低（10-1010-6g/ml），且難以通過(guò)增加體內(nèi)樣品量提高方法靈敏度。目前，體內(nèi)藥物分析常用的檢測(cè)方法主要有色譜分析法、免疫分析法和生物學(xué)方法。1.色譜分析法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，可用于大多數(shù)小分子藥物的體內(nèi)檢測(cè)。目前色譜分析法，尤其是HPLC及其聯(lián)用技術(shù)LC-MS與LC-MS-MS已經(jīng)成為體內(nèi)樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物分析檢測(cè)的首選方法，并逐步應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子類藥物或內(nèi)源性物質(zhì)的檢測(cè)與分析。2.免疫分析法主要有放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、熒光免疫分析法（FIA）等，多用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子類物質(zhì)的檢測(cè)。3.生物學(xué)方法微生物學(xué)方法常能反映藥效學(xué)的本質(zhì)，可用于抗生素類藥物的體內(nèi)分析。但生物學(xué)方法一般特異性較差，常需采用特異性高的方法（如色譜分析法）進(jìn)行平行監(jiān)測(cè)。第二部分 體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、體內(nèi)樣品的種類體內(nèi)樣品包括各種體液與組織。但是，在體內(nèi)藥物分子中最為常用的樣本是血液，它能較為準(zhǔn)確地反應(yīng)藥物在體內(nèi)的狀況。尿液中含有豐富的藥物代謝物，也被較多地使用。唾液因采集便利且有時(shí)與血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性而時(shí)有使用。而臟器組織，除非特別需要，在治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）中很少使用。二、體內(nèi)樣品的采集與制備（一）血樣血樣包括全血（wholeblood）、血漿（plasma）和血清（serum），是最為常用的體內(nèi)樣品。血藥濃度檢測(cè)，除非特別說(shuō)明外，通常指血漿或血清的藥物濃度測(cè)定。當(dāng)藥物在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài)時(shí)，血漿中藥物濃度能夠反應(yīng)藥物在靶器官的狀況，因而血漿藥物濃度可作為體內(nèi)藥物濃度的可靠指標(biāo)。1全血的采集人體采血，通常采集靜脈血，有時(shí)從毛細(xì)血管采血（成人多從手指或耳垂取血，小兒多從腳趾取血）用于臨床化驗(yàn)。根據(jù)分析方法靈敏度的要求，一般每次采血量15ml；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接從動(dòng)脈或心臟取血。全血采集后，置含有抗凝劑（肝素、EDTA、枸櫞酸鹽、草酸鹽等）的試管中，混合均勻，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞處于均相，即為全血樣品。2血漿的制備將采集的全血置含有抗凝劑的試管中，混勻后，以約1000g離心力，離心510分鐘，促進(jìn)血紅細(xì)胞沉降分離，所得淡黃色上清液即為血漿。最常用的抗凝劑是肝素（heparin）。肝素是體內(nèi)正常生理成分，因此不致改變血樣的化學(xué)組成或引起藥物的變化，一般不會(huì)干擾藥物的測(cè)定。3.血清的制備采集的全血不加抗凝劑，室溫放置至少30分鐘1小時(shí)，待血液凝固后，以約1000g離心力，離心1020分鐘，上層淡黃色澄清液體即為血清。在凝血過(guò)程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無(wú)纖維蛋白原。因藥物與纖維蛋白幾乎不結(jié)合，所以血漿與血清中的藥物濃度通常是相同的。作為血藥濃度測(cè)定的樣品，血漿和血清可任意選用。但無(wú)論是采用血漿還是血清，現(xiàn)有的文獻(xiàn)、資料所列的血藥濃度，均系指血漿或血清中藥物的總濃度（游離+與血漿蛋白結(jié)合）。血漿比血清分離得快，而且制取的量約為全血的5060（血清只為全血的2040），多數(shù)研究者使用血漿。若血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品。若需專門(mén)測(cè)定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度，則應(yīng)使用全血樣品；某些情況下由于血漿內(nèi)藥物濃度波動(dòng)太大，且又難以控制，或因血漿藥物濃度很低而影響測(cè)定，也應(yīng)考慮使用全血樣品。如：氯噻酮可與紅細(xì)胞結(jié)合，在血細(xì)胞中的藥物濃度比血漿中藥物濃度大50100倍，且其動(dòng)力學(xué)行為亦與在血漿中不同，因此宜用全血樣品測(cè)定。（二）尿樣體內(nèi)藥物清除主要通過(guò)腎臟排泄，經(jīng)尿液排出。尿藥測(cè)定主要用于藥物的劑量回收、尿清除率研究。同時(shí)，當(dāng)藥物在血中濃度過(guò)低難以準(zhǔn)確測(cè)定時(shí)，尿藥測(cè)定亦用于藥物制劑的生物利用度研究，以及根據(jù)藥物劑量回收研究可以預(yù)測(cè)藥物的代謝過(guò)程及測(cè)定藥物的代謝類型等。尿樣包括隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿幾種。健康人排出的尿液是淡黃色或黃褐色的，pH在4.88.0之間。放置后會(huì)析出鹽類，并有細(xì)菌繁殖、固體成分的崩解使尿液變混濁。因此，尿液采集后如不能立即測(cè)定，需低溫冰凍保存或加入防腐劑后冷藏保存。常用的防腐劑有二甲苯、三氯甲烷、醋酸、鹽酸等。保存時(shí)間為2436小時(shí)，可置冰箱（4）中；長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)，應(yīng)冰凍（20或8070）。體內(nèi)藥物的清除可能以原形（母體藥物）或代謝物及其綴合物等形式排出。尿液中藥物濃度大都較高，收集量可以很大（成人一日排尿量為15L）。但由于易受食物種類、飲水多少、排汗情況等影響，常使尿藥濃度變化較大，故測(cè)定尿液中藥物濃度時(shí)，一般采用時(shí)間尿（一定時(shí)間區(qū)間的尿液），以某一時(shí)間段或單位時(shí)間內(nèi)尿中藥物的總量（排泄量或排泄率）表示。測(cè)定尿液中藥物的總量時(shí)，應(yīng)收集服藥后一定時(shí)間內(nèi)（如24小時(shí)）各時(shí)間段排泄的全部尿液，記錄體積；量取一部分測(cè)定尿液藥物濃度，乘以尿液量，計(jì)算尿藥排泄總量。（三）唾液一些藥物的唾液濃度與血漿游離濃度呈現(xiàn)密切相關(guān)，因此在TDM工作中有可能利用測(cè)定唾液中藥物濃度進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)。另外，唾液樣品也可用于藥物動(dòng)力學(xué)的研究。唾液是由腮腺、舌下腺和頜下腺三個(gè)主要的唾液腺分泌匯集而成的混合液體。正常成年人唾液分泌量每天約為11.5L。唾液的pH為6.27.4，當(dāng)分泌增加時(shí)，pH會(huì)更高。唾液的采集一般在漱口后約15分鐘進(jìn)行，應(yīng)盡可能在刺激少的安靜狀態(tài)下收集口腔內(nèi)自然流出的唾液。唾液樣品采集后，應(yīng)立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積。放置后分成泡沫部分、透明部分及乳白色沉淀部分三層。以3000r/min離心10分鐘，取上清液作為藥物濃度測(cè)定的樣品。唾液應(yīng)在4以下保存，冷凍保存唾液時(shí)，解凍后有必要將容器內(nèi)唾液充分?jǐn)噭蚝笤儆茫駝t測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生誤差。（四）組織在藥物的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床上由于過(guò)量服用藥物而引起的中毒死亡時(shí)，藥物在臟器組織中的分布情況可為藥物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過(guò)程提供重要信息。常用的臟器組織有：胃、肝、腎、肺、心、腦等臟器及其他組織。體內(nèi)各種臟器組織樣品在測(cè)定之前，首先需均勻化制成水性基質(zhì)勻漿溶液，然后再用適當(dāng)方法萃取藥物。勻漿化操作系將組織樣品中加入一定量的水或緩沖液，在刀片式勻漿機(jī)中勻漿，使待測(cè)藥物釋放、溶解，分取上清液測(cè)定。第三部分 體內(nèi)樣品的前處理去除蛋白和液-液萃取法在測(cè)定體內(nèi)藥物及其代謝物時(shí)，除少數(shù)情況將體液作簡(jiǎn)單處理后直接測(cè)定外，一般在測(cè)定之前要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，為藥物的測(cè)定創(chuàng)造良好條件。樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)，也是分析中最困難，最繁復(fù)的工作。由于藥物自身的理化特性和存在形式以及生物介質(zhì)的差異，對(duì)于體內(nèi)樣品的預(yù)處理很難規(guī)定統(tǒng)一方法和固定的程序，而必須結(jié)合后續(xù)的測(cè)定方法對(duì)分析樣品的要求，采取恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理步驟。一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的1、使待測(cè)藥物游離藥物進(jìn)入體內(nèi)后，即與血漿蛋白結(jié)合，同時(shí)部分經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生成代謝物及綴合物。通過(guò)預(yù)處理，使待測(cè)藥物或代謝物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物或代謝物的總濃度。2、滿足測(cè)定方法的要求體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復(fù)雜、干擾多，而待測(cè)藥物組分濃度低。因此，需將樣品進(jìn)行適當(dāng)處理，使組分得到凈化和富集，以滿足測(cè)定方法對(duì)分析樣品的要求。3、為了防止分析儀器的污染、劣化，提高測(cè)定靈敏度和選擇性等。如采用HPLC法測(cè)定，為防止蛋白質(zhì)在色譜柱上的沉積、堵塞，需要除去血漿蛋白質(zhì)。預(yù)處理不僅可以延長(zhǎng)色譜柱的壽命，也可以改善方法的選擇性（排除生物介質(zhì)的干擾）和組分的可測(cè)性或組分的色譜行為。二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法常用體內(nèi)樣品的預(yù)處理方法一般有蛋白沉淀法、液-液萃取法、液-固萃取法。特殊情況下需進(jìn)行綴合物水解、化學(xué)衍生化等。（一）蛋白沉淀法在測(cè)定血樣時(shí)，首先應(yīng)去除蛋白質(zhì)。去除蛋白質(zhì)可使結(jié)合型的藥物釋放出來(lái)，以便測(cè)定藥物的總濃度。去除蛋白法有以下幾種方法。1、溶劑沉淀法加入與水相混溶的有機(jī)溶劑（親水性有機(jī)溶劑），蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增加而聚集。常用的水溶性有機(jī)溶劑有乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃等。含藥物的血漿或血清與水溶性有機(jī)溶劑的體積比為1:（23）時(shí)，可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去。上清液偏堿性，pH為8.59.5。操作時(shí)，將水溶性有機(jī)溶劑與血漿或血清混合后離心分離，取上清液作為供試溶液。通常用于分離血漿或血清的離心力（約1000g）不能將蛋白質(zhì)沉淀完全，而采用高速離心（離心力約15000g）約5分鐘便可將析出的蛋白質(zhì)沉淀完全。2、中性鹽析法加入中性鹽，溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)因分子間電排斥作用減弱而凝聚。常用的中性鹽有飽和硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。操作時(shí)，按血清與飽和鹽溶液的比例為1:（23）混合，高速離心約2分鐘，即可除去90%以上的蛋白質(zhì)。所得上清液近中性，pH為7.07.7。3、強(qiáng)酸沉淀法當(dāng)溶液pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，可與酸根陰離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強(qiáng)酸有10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液。含藥物血清與強(qiáng)酸的比例為10.6混合，高速離心約2分鐘，就可以除去90%以上的蛋白質(zhì)。因加入了強(qiáng)酸，上清液呈強(qiáng)酸性（pH04），在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。4、熱凝固法當(dāng)待測(cè)物熱穩(wěn)定性好時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白質(zhì)沉淀。加熱溫度視待測(cè)組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜嶂?0。蛋白沉淀后可用離心或過(guò)濾法除去，這種方法最簡(jiǎn)單，但只能除去熱變性蛋白。（二）液-液萃取法（liquid-liquidextraction，LLE）液-液萃取法是傳統(tǒng)的分離、濃集方法。多數(shù)藥物是親脂性的，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中的溶解度大于在水相的溶解度，而血樣或尿樣中含有的大多數(shù)內(nèi)源性干擾物質(zhì)是強(qiáng)極性的水溶性物質(zhì)，因而可用有機(jī)溶劑提取法除去大部分內(nèi)源性干擾物質(zhì)。樣品在提取過(guò)程中，雖然待測(cè)組分得到了凈化，但因微量的組分分布在較大體積的提取溶劑中，常需要使待測(cè)組分濃集后再進(jìn)行測(cè)定。方法是揮去提取溶劑，殘?jiān)鼜?fù)溶于小體積的溶劑。揮去提取溶劑的常用方法是直接通入氮?dú)饬鞔蹈?；?duì)于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。溶劑蒸發(fā)所用的試管，底部應(yīng)為尖錐形，這樣可使最后數(shù)微升溶劑集中在管尖，便于待測(cè)組分的復(fù)溶與分取。應(yīng)用液-液萃取法時(shí)要考慮所選有機(jī)溶劑的特性、有機(jī)溶劑相和水相的體積及水相的pH等。1、溶劑的選擇溶劑的選擇應(yīng)根據(jù)相似相溶的原則進(jìn)行，選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意：對(duì)藥物分子的未電離形式可溶，而對(duì)電離形式不溶；沸點(diǎn)低、易揮發(fā)；與水不相混溶；無(wú)毒、不易燃燒；具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性；不影響紫外檢測(cè)。常用液-液萃取的溶劑 2、溶劑的用量一般有機(jī)相與水相（體內(nèi)樣品）體積比為1151。3、水相的pH當(dāng)pH與pKa相等時(shí)，50的藥物以非電離形式存在。對(duì)于堿性藥物最佳pH為高于pKa12個(gè)pH單位；對(duì)于酸性待測(cè)藥物，則要低于pKa12單位。這樣，就可使得90%的藥物以非電離形式存在，而更易溶于有機(jī)溶劑中。4、提取操作一般只提取一次。若提取回收率較低（如低于50%）時(shí)，可提取23次；若干擾物質(zhì)為脂溶性，不易除去，則可將提取分離出的含藥有機(jī)相再用一定pH的小體積水溶液反提取后測(cè)定，或?qū)⒎刺崛∫涸儆糜袡C(jī)溶劑提取，如此反復(fù)提取可將藥物與干擾物質(zhì)有效分離。液-液提取法的優(yōu)點(diǎn)在于它的選擇性和低廉的運(yùn)行成本，以及可對(duì)樣品進(jìn)行凈化和濃集的特點(diǎn)。所以本法在體內(nèi)藥物分析中，尤其是采用LC-MS測(cè)定時(shí)被廣泛應(yīng)用。（三）固相萃取法及其他方法由于高效液相色譜，尤其是反相高效液相色譜的成功應(yīng)用，啟示人們利用色譜理論，采用裝有不同填料的小柱進(jìn)行體內(nèi)樣品的預(yù)處理，而發(fā)展了固相萃?。╯olid-phaseextraction，SPE）技術(shù)。SPE技術(shù)亦稱液-固萃取技術(shù)，它的應(yīng)用大大縮短了樣品處理時(shí)間，同時(shí)可避免乳化現(xiàn)象，而且便于自動(dòng)化操作。1、固相萃取法（solid-phaseextraction，SPE）（1）SPE原理將不同填料作為固定相裝入微型小柱，當(dāng)含有藥物的體內(nèi)樣品溶液通過(guò)小柱時(shí)，由于受到“吸附”、“分配”、“離子交換”或其他親和力作用，藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時(shí)被保留在固定相（填料）上，用適當(dāng)溶劑洗除干擾物質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。藥物的洗脫方式有兩種：一種是藥物比干擾物質(zhì)與固定相之間的親和力更強(qiáng)，因而在用沖洗溶劑洗去干擾物質(zhì)時(shí)藥物被保留，然后用一種對(duì)藥物親和力更強(qiáng)的溶劑洗脫藥物；是干擾物質(zhì)較藥物與固定相之間的親和力更強(qiáng)，則藥物被直接洗脫，干擾物質(zhì)被保留在萃取柱上，使用較多的是前一種洗脫模式。SPE的填料種類繁多，可分成親脂型（大孔吸附樹(shù)脂、親脂性鍵合硅膠）、親水型（硅膠、硅藻土、棉纖維）和離子交換型三類，其中親脂型用得最多。烷基、苯基、氰基鍵合硅膠都可用作固相萃取吸附劑，其中十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18）最常用。親脂性鍵合硅膠容易吸附水中的非極性物質(zhì)，易用有機(jī)溶劑洗脫，適用于萃取、凈化水基質(zhì)體液中疏水性藥物。常見(jiàn)的商品SPE柱有Sep-PakC18、Bond-ElutC18、CN（氰基）、C2（乙基）、Ph（苯基）Baker10C18等。（2）SPE操作步驟使用親脂性鍵合相硅膠SPE柱的一般操作步驟如下?；罨眉状紳?rùn)濕小柱，活化填料，以使固相表面易于和待測(cè)組分發(fā)生分子間相互作用，同時(shí)可以除去填料中可能存在的干擾物質(zhì)。溶劑交換（平衡）用水或適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗小柱，去除過(guò)多的甲醇，但沖洗不宜過(guò)分。否則會(huì)使甲醇含量過(guò)低（低于5%），導(dǎo)致C18鏈彎曲折疊，對(duì)待測(cè)物的吸附能力下降，造成萃取回收率降低。加樣使體內(nèi)樣品通過(guò)小柱，并棄去濾過(guò)廢液。淋洗用水或適當(dāng)緩沖液沖洗小柱，去除吸附于固定相上的內(nèi)源性物質(zhì)或其他相關(guān)干擾物質(zhì)。洗脫選擇適當(dāng)?shù)南疵撊軇┫疵摯郎y(cè)物，收集洗脫液，揮干溶劑備用或直接進(jìn)行在線分析。使用親脂性鍵合硅膠SPE柱時(shí)，需注意：體液樣品（如血漿等）通過(guò)萃取柱的流速控制在12ml/min。沖洗液和洗脫劑的強(qiáng)度、用量要適當(dāng)，否則會(huì)導(dǎo)致藥物的損失或洗脫選擇性下降。通常選用可與水混溶的洗脫劑。萃取堿性藥物時(shí)，洗脫劑中常需加酸、有機(jī)胺或氨水、醋酸銨或離子對(duì)試劑。對(duì)于大量樣品的處理，則有賴于半自動(dòng)化和全自動(dòng)化的儀器。半自動(dòng)SPE是指萃取過(guò)程機(jī)械化，但將洗脫液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣器則需要手工操作。全自動(dòng)化儀器是通過(guò)柱切換技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，利用切換閥使固相萃取小柱直接聯(lián)入流路中。2、超濾法超濾法（ultrafiltration）是以多孔性半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。通過(guò)選用不同孔徑的不對(duì)稱性微孔膜、按照截留分子量的大小，可分離301000kD的可溶性生物大分子物質(zhì)。與通常的分離方法相比，超濾具有不引入化學(xué)試劑，沒(méi)有相態(tài)變化，對(duì)待測(cè)藥物的破壞性小等優(yōu)點(diǎn)。血液中游離藥物的測(cè)定可采用分子量截留值在5萬(wàn)左右的超濾膜，用加壓（2kg/cm2）過(guò)濾法或用高速離心法將血漿或血清中游離型藥物與分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了藥物的血漿蛋白分離，從超濾液或離心液中得到游離型藥物，然后可直接或經(jīng)濃縮后測(cè)定其濃度。3、綴合物水解藥物或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物稱為綴合物（conjugate）。內(nèi)源性物質(zhì)有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特別是前兩種為最重要的內(nèi)源性物質(zhì)。一些含羥基、羧基、氨基和巰基的藥物，可與內(nèi)源性物質(zhì)葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷綴合物；還有一些含酚羥基、芳胺及醇類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)硫酸形成硫酸酯綴合物。尿中藥物多數(shù)呈綴合狀態(tài)。由于綴合物較原形藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取。為了測(cè)定尿液中藥物總量，需對(duì)綴合物進(jìn)行水解，將綴合物中的藥物釋出。常用的方法如下：（1）酸水解法酸水解時(shí)，可加入適量的鹽酸溶液。酸的用量和濃度、反應(yīng)時(shí)間及溫度等條件，隨藥物的不同而異。這些條件應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。該法比較簡(jiǎn)便、快速，但有些藥物在水解過(guò)程中會(huì)發(fā)生分解；與酶水解法相比，其專一性較差。（2）酶水解法對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，可以采用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶（glucuronidase）或硫酸酯酶（sulfatase）。前者可專一地水解藥物的葡萄糖醛酸苷綴合物，后者水解藥物的硫酸酯綴合物。實(shí)際應(yīng)用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶。一般控制pH為4.55.5，37培育數(shù)小時(shí)進(jìn)行水解。酶水解比酸水解溫和，一般不會(huì)引起待測(cè)物分解，且酶水解專屬性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是酶水解時(shí)間稍長(zhǎng)及酶制劑可能帶入的黏蛋白導(dǎo)致乳化或色譜柱阻塞。盡管如此，酶水解仍被優(yōu)先選用。在尿液中采用酶水解，應(yīng)事先除去尿中能抑制酶活性的陽(yáng)離子。（3）溶劑解法綴合物（主要是硫酸酯）往往可通過(guò)加入的溶劑在萃取過(guò)程中被分解，稱作溶劑解（solvolysis）。例如尿中的甾體硫酸酯在pH1時(shí)加醋酸乙酯提取，產(chǎn)生溶劑解，這時(shí)的條件也比較溫和。值得注意的是，目前對(duì)綴合物的分析逐漸趨向于直接測(cè)定綴合物的含量（如采用HPLC和RIA法），以獲得在體內(nèi)以綴合物形式存在的量，以及當(dāng)排出體外時(shí)，綴合物占所有排出藥物總量的比率，從而為了解藥物代謝情況提供更多的信息。4、化學(xué)衍生化某些藥物或代謝物極性大、揮發(fā)性低或?qū)z測(cè)器不夠靈敏，使用常規(guī)的HPLC或GC難以有效測(cè)定，需要先進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后測(cè)定衍生物。藥物分子中含有活潑氫者均可被化學(xué)衍生化，如含有RCOOH、ROH、RNH2、RNHR等官能團(tuán)的藥物都可進(jìn)行衍生化。第四部分 體內(nèi)分析方法的建立與方法驗(yàn)證一、體內(nèi)分析方法建立的一般程序取待測(cè)藥物或其特定的活性代謝產(chǎn)物、內(nèi)標(biāo)等的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行條件試驗(yàn)，通過(guò)調(diào)整色譜條件，使待測(cè)藥物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)具有良好的色譜參數(shù)及峰面積，并有效避開(kāi)內(nèi)源性物質(zhì)的干擾；同時(shí)選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器，以獲得足夠的檢測(cè)靈敏度。二、體內(nèi)分析方法的驗(yàn)證體內(nèi)分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容包含分析方法的效能指標(biāo)、樣品穩(wěn)定性及提取回收率。分析方法的效能指標(biāo)包括特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度。分析方法驗(yàn)證通常采用標(biāo)準(zhǔn)樣品與質(zhì)控樣品，其含義如下：1、質(zhì)控樣品（qualitycontrolsample，QC）在空白生物介質(zhì)中加入已知量（高、中、低三水平）待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成的樣品，用于監(jiān)測(cè)生物分析方法的效能和評(píng)價(jià)每一分析批樣品分析結(jié)果的完整性和正確性。2、標(biāo)準(zhǔn)樣品（standardsample）在空白生物介質(zhì)中加入已知量待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制成的系列濃度的樣品，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)控（QC）樣品和未知樣品中待測(cè)物的濃度。（一）特異性方法的特異性，又稱選擇性，用以證明該方法所測(cè)定的物質(zhì)是預(yù)期的待測(cè)物（原形藥物或特定的活性代謝物），而體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)、降解產(chǎn)物及其他共同使用的藥物（伍用藥物）不干擾樣品的測(cè)定。1、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾分別測(cè)定待測(cè)藥物、活性代謝物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，及6個(gè)不同個(gè)體的空白生物介質(zhì)和QC樣品，比較圖譜或檢測(cè)信號(hào)，確證內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)分析方法無(wú)干擾。對(duì)于以軟電離質(zhì)譜為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法（LC-MS或LC-MS/MS）應(yīng)注意考察分析過(guò)程中的介質(zhì)效應(yīng)，如離子抑制等。2、未知代謝產(chǎn)物的干擾測(cè)定QC樣品和6個(gè)不同個(gè)體用藥后的實(shí)際體內(nèi)樣品，比較圖譜或檢測(cè)信號(hào)，確證其他代謝產(chǎn)物對(duì)分析方法無(wú)干擾。必要時(shí)可通過(guò)HPLC-DAD和LC-MS（或LC-MS/MS）確證被測(cè)定色譜峰的純度。3、伍用藥物的干擾測(cè)定待測(cè)藥物及伍用藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液、QC樣品和添加有伍用藥物的干擾樣品，比較圖譜或檢測(cè)信號(hào)，確證伍用藥物對(duì)分析方法無(wú)干擾。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve），亦稱校正曲線（calibrationcurve）或工作曲線（workingcurve），反映了體內(nèi)分析所測(cè)定藥物的濃度與儀器響應(yīng)值（如HPLC峰面積）的關(guān)系，一般用回歸方程來(lái)評(píng)價(jià)。最常用的回歸分析法為最小二乘法（leastsquares）或加權(quán)最小二乘法（weightedleastsquares）。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的一般步驟如下：1、系列標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備取空白生物介質(zhì)數(shù)份，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制備至少包含6個(gè)濃度點(diǎn)的（不包括零點(diǎn)，即空白樣品）系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品（standardsamples）。濃度系列一般為等比梯度模式，通常比例常數(shù)約為2，如1、2、5、10、20、50、100。在此系列中，若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為50，其1/20為2.5，考慮到個(gè)體差異，設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1，可覆蓋全部待測(cè)體內(nèi)樣品中的藥物濃度。內(nèi)標(biāo)溶液的濃度一般選擇與系列“標(biāo)準(zhǔn)溶液”的幾何平均濃度，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間濃度（如系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1、2、5、10、20、50和100時(shí)，中間濃度為10）相當(dāng)。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，按擬定方法預(yù)處理后分析，以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng)（因變量，y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的藥物濃度（自變量，x），用最小二乘法或加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析，求得回歸方程（y=a+bx）及其相關(guān)系數(shù)（），并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍要能覆蓋全部待測(cè)的體內(nèi)樣品濃度范圍，定量上限（upperlimitofquantification，ULOQ，標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)）應(yīng)高于用藥后生物介質(zhì)中藥物的峰濃度（Cmax）；定量下限（lowerlimitofquantification，LLOQ，最低濃度）應(yīng)低于Cmax的10%5%（1/101/20）。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距應(yīng)接近于零，若顯著偏離零點(diǎn)，應(yīng)確證其對(duì)方法的準(zhǔn)確度無(wú)影響；斜率應(yīng)接近或大于1（與坐標(biāo)的標(biāo)度選擇有關(guān)），使具有較高的靈敏度；相關(guān)系數(shù)應(yīng)接近于1，即具有良好的相關(guān)性，如色譜法0.99。（三）定量下限定量下限（LLOQ）是標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，表示方法的靈敏度，即測(cè)定樣品中符合準(zhǔn)確度和精密度要求的最低藥物濃度。測(cè)定方法是取同一生物介質(zhì)，制備至少5個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品，其濃度應(yīng)使信噪比（S/N）大于5，依法進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證。在藥代動(dòng)力學(xué)與生物利用度研究中，LLOQ應(yīng)能滿足35個(gè)消除半衰期時(shí)體內(nèi)樣品中的藥物濃度或Cmax的1/201/10的藥物濃度的測(cè)定。（四）精密度與準(zhǔn)確度精密度（precision）是指在確定的分析條件下相同生物介質(zhì)中相同濃度樣品的一系列測(cè)量值的分散程度，通常用QC樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）表示。在體內(nèi)藥物分析過(guò)程中，無(wú)論是藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的獲得或是治療藥物的監(jiān)測(cè)，通常在1個(gè)分析批（analyticalrun）內(nèi)難以完成全部體內(nèi)樣品的分析。而在不同的分析批之間的實(shí)驗(yàn)條件（如儀器性能、參數(shù)、試劑來(lái)源、實(shí)驗(yàn)溫度、濕度等）有可能發(fā)生小的改變，進(jìn)而對(duì)分析結(jié)果可能產(chǎn)生影響。所以在體內(nèi)藥物分析中，方法精密度除要評(píng)價(jià)批內(nèi)（within-run或intra-batch）RSD外，同時(shí)還應(yīng)評(píng)價(jià)批間（between-run或inter-batch）RSD。準(zhǔn)確度（accuracy）是指在確定的分析條件下測(cè)得的體內(nèi)樣品濃度與真實(shí)濃度的接近程度，通常用QC樣品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的相對(duì)回收率（relativerecovery,RR）或相對(duì)偏差（relativeerror,RE）表示。1、測(cè)定法使用QC樣品進(jìn)行考察，一般選擇高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品同時(shí)進(jìn)行方法的精密度和準(zhǔn)確度考察。每個(gè)QC樣品測(cè)定1次。在測(cè)定批內(nèi)RSD時(shí)，每一濃度至少制備