CAT 測(cè)定方法

二、氧化氫酶的活性測(cè)定-高錳酸鉀滴定法 原理 過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過 程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 據(jù)此，可根據(jù)H202的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量(反應(yīng)過量)的H2O2溶液，經(jīng)過酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 儀器和用具 研缽；三角瓶50ml4個(gè)；10ml酸式滴定管；恒溫水浴鍋；容量瓶25ml1個(gè)。 試劑 10H2SO4； 02mol?L-1磷酸緩沖液pH7.8; 01mol?L-1高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液；稱取KmnO4(AR)3.160克，用新煮沸泠卻的蒸餾水配制成1000ml,用0.1moL.L-1草酸溶液標(biāo)定； 0.1mol.l-1H2O2：市售30H202大約等于176m01?L-1，取30H202溶液568ml,稀釋至于1000ml,用標(biāo)準(zhǔn)0.1molKMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定 0.1mol.L-1 草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸餾水溶解后，定容至1L。 方法 1酶液提?。喝⌒←溔~片25g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000r?min-1離心15min,上清液即為過氧化氫酶的粗提液。 2取50ml三角瓶4個(gè)(2個(gè)測(cè)定，2個(gè)對(duì)照)，測(cè)定瓶中加入酶液2.5ml，對(duì)照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol01?L-1H202，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10H2S042.5ml 3用0.1mol?L-1KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H202，至出現(xiàn)粉紅色(在30min內(nèi)不消失)為終點(diǎn)。 4結(jié)果計(jì)算：酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H202的毫克數(shù)表示： 酶活（mg.g-1.min-1）= 式中 A-對(duì)照KMn04滴定毫升數(shù)(ml) B-酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)（ml） VT-酶液總量（ml）; V1-反應(yīng)所用酶液量（ml）W-樣品鮮重（g） 1.7-1ml0.1mol.L-1的KMnO4相當(dāng)于1.7mgH2O2. 注意 所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定。 三、過氧化氫酶的活性-紫外吸收法 原理 H202在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240）隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性。儀器與用具 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；容量瓶250ml1個(gè)；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml試管3支；恒溫水浴鍋。試劑 0.2mol?L-1pH78磷酸緩沖液(內(nèi)含1聚乙烯吡咯烷酮)；01mol?L-1H202(用01mol?L-1高錳酸鉀標(biāo)定)。 方法 1酶液提取 稱取新鮮小麥葉片或其他植物組織05g，置研缽中，加入2-3ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?，將量瓶置5冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液，5下保存?zhèn)溆谩?2測(cè)定 取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表42-2順序加入試劑。 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按式42-3計(jì)算酶活性。 3結(jié)果計(jì)算 以1min內(nèi)A240減少01的酶量為1個(gè)酶活單位(u)。過氧化氫酶的活性（u.g-1min-1）= 式中 Aso-加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；As1,As2-樣品管吸光值；Vt-粗酶提取液總體積(ml);V1-測(cè)定用粗酶液體積(ml); FW-樣品鮮重(g); 01-A20每下降01為1個(gè)酶活單位(u);t-加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)。 注意:凡在240nm下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)有干擾。 【思考題】1、影響過氧化氫酶活性測(cè)定的因素有哪些?2、過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)? 參考文獻(xiàn) 【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170 【2】蔣明義，郭紹剛，滲透脅迫下稻苗鐵催化的膜脂過氧化作用.植物生理學(xué)報(bào).1996.22(1):6-12 【3】林植芳，李雙順等.衰老葉片和葉綠體中H2O2的積累與膜脂過氧化的關(guān)系，植物生理學(xué)報(bào).1998,14(1):16-22 【4】鄒琦.植物生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995 【5】【美】吉爾鮑特GG.繆輝南，陳石根等譯.酶法分析手冊(cè).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982 過氧化氫酶pH值范圍4-9,而以7.0,37最適。冷凍、凍干、陽光、氧氣降酶活。用Beers&Sizers法（改 進(jìn)型）測(cè)定。見德B 施特爾馬赫著，錢嘉淵譯 酶的測(cè)定方法 p186-188。1.試劑：(1)1N氫氧化鈉溶液：稱2g，用蒸餾水定容至50ml。(2)磷酸鹽緩沖液（pH7.0）：取0.68g磷酸二氫鉀，溶于75ml蒸餾水，用1N氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至7.0，定容至100ml。(3)底物溶液：現(xiàn)配。用磷酸鹽緩沖液把0.6ml過氧化氫（30的H2O2）稀釋至100ml。(4)酶液濃度應(yīng)為5-20u/ml。2.操作： 用移液管將1.0ml底物溶液和1.9ml蒸餾水滴入一只1厘米比色皿，并調(diào)水溫至25。為檢查在不加酶的情況下吸光度是否也降低，在240nm處以蒸餾水為參比測(cè)定吸光度，若吸光度的降低幅度超過0.01，則在計(jì)算主值時(shí)須減去此值。取另一比色皿，加入上述溶液，并加0.10酶溶液，在240nm處以蒸餾水為參比在連續(xù)5分鐘內(nèi)測(cè)定吸光度（每隔1分鐘讀取一次結(jié)果，直至每分鐘吸光度的降低值達(dá)到穩(wěn)定為止）。3.計(jì)算：在上述條件下，每分鐘酶促分解1umol過氧化氫的酶量定為1個(gè)酶活力單位。U/mg = E2403 / 0.0436Ew式中：E240240nm處每分鐘內(nèi)吸光度的降低值 Ew每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg） 0.0436240nm處1umol過氧化氫的吸光度 3反應(yīng)混合液的總體積。5 波欽諾克 X H 著.植物生物化學(xué)分析方法.荊家海，丁釧榮譯.北京:科學(xué)出版社，1981.205207參考文獻(xiàn)【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170【2】蔣明義，郭紹剛，滲透脅迫下稻苗鐵催化的膜脂過氧化作用.植物生理學(xué)報(bào).1996.22(1):6-12【3】林植芳，李雙順等.衰老葉片和葉綠體中H2O2的積累與膜脂過氧化的關(guān)系，植物生理學(xué)報(bào).1998,14(1):16-22【4】鄒琦.植物生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995【5】【美】吉爾鮑特GG.繆輝南，陳石根等譯.酶法分析手冊(cè).上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982實(shí)驗(yàn)13 過氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法）過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測(cè)定。一、原理過氧化氫酶（catalase）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的H2O2的量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小麥葉片（二）儀器設(shè)備：1. 研缽；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒溫水??；5. 容量瓶。（三）試劑：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液；3. 0.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液標(biāo)定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大約等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5. 0.1mol/L 草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1000ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）酶液提?。喝⌒←溔~片2.5g加入pH7.8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽，并將沖洗液轉(zhuǎn)至容量瓶中，用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測(cè)定，另兩個(gè)為對(duì)照），測(cè)定瓶加入酶液2.5ml，對(duì)照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)，于30恒溫水浴中保溫10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/L KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。五、結(jié)果酶活性用每g鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的mg數(shù)表示：過氧化氫酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(WVS1.7t)式中：A對(duì)照KMnO4滴定ml數(shù)；B酶反應(yīng)后KMnO4滴定ml數(shù)；VT提取酶液總量（ml）；VS反應(yīng)時(shí)所用酶液量（ml）；W樣品鮮重（g）；t反應(yīng)時(shí)間（min）；1.71ml0.1mol/L KMnO4相當(dāng)于1.7mgH2O2。過氧化氫酶活性測(cè)定一、目的：植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。二、測(cè)定方法：（一）過氧化氫分解量測(cè)定法原理：過氧化氫酶（catalase）能把過氧化氫分解為水和氮，其活性大小，以一定時(shí)間內(nèi)分解的過氧化氫的量來表示。當(dāng)酶與底物（過氧化氫）反映結(jié)束后，再用碘量法測(cè)定未分解的過氧化氫量。以鉬酸銨做催化劑，使過氧化氫與碘化鉀反映，放出游離碘，然后用硫代硫酸鈉滴定碘，其反應(yīng)為：H2O2+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6(二) 氧量測(cè)定法原理：過氧化氫酶能把過氧化氫分解為水和氧，其活性大小，根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)放出的氧量來表示。（三）過氧化氫酶的活性測(cè)定高錳酸鉀滴定法原理： 過氧化氫酶屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過 程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 據(jù)此，可根據(jù)H202的消耗量或O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量(反應(yīng)過量)的H2O2溶液，經(jīng)過酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液(在酸性條件下)滴定多余的H2O2 。5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4（四）過氧化氫酶活性測(cè)定紫外吸收法原理：過氧化氫在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240）隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性。三、過氧化氫分解量測(cè)定法的儀器與試劑（一）植物材料小麥或其他植物新鮮葉片（二）儀器與用具天平，研缽，100ml容量瓶2個(gè)，50ml的酸式滴定管1支，恒溫水浴鍋，10ml移液管的1支，5ml移液管的2支，1ml移液管的1支，100ml的三角瓶4個(gè)。（三）試劑與配制1碳酸鈣粉末23.6N硫酸：取1000毫升燒杯一只，加入約500毫升蒸餾水，邊攪拌邊加入100毫升濃硫酸，冷卻后用1000毫升的容量瓶定容。31%淀粉溶液：取1克可容性淀粉于小燒杯中加約20毫升水調(diào)勻，慢慢傾入約80毫升沸水中，在攪拌下加熱至重新沸騰，冷卻后貯存于滴瓶中（可加少量的碘化汞防腐）。410%鉬酸銨溶液：稱取鉬酸銨10克，容于蒸餾水中使成100毫升。50.1N硫代硫酸鈉：稱取Na2S2O3?5H2O 25克，容于新煮沸并冷卻過的蒸餾水中，加入約0.1克Na2CO3,并稀釋至1升，保存于棕色試劑瓶中，放置暗處。一天后進(jìn)行標(biāo)定。60.02N硫代硫酸鈉：用20毫升移液管吸取標(biāo)定過的0.1N硫代硫酸鈉溶液20毫升，加入100毫升的容量瓶中，加水定容，搖勻即成，用時(shí)現(xiàn)配。70.1N過氧化氫：取1毫升30%的過氧化氫用水稀釋至150毫升，用0.1N硫代硫酸鈉標(biāo)定。（四）方法步驟：1酶液提?。悍Q取混勻的新鮮植株葉片0.25克（盡量不要切葉脈），置研缽中加0.2克碳酸鈣和PH7.8的磷酸緩沖溶液5毫升，仔細(xì)研磨成勻漿，通過漏斗移入15ml試管中，再用5ml該緩沖溶液沖洗缽體，一并轉(zhuǎn)入漏斗過濾，所得濾液即為待測(cè)酶液。2.測(cè)定：取100毫升三角評(píng)4個(gè)，編號(hào)。向各瓶準(zhǔn)確加入稀釋后的酶液10毫升，立即向3，4號(hào)瓶中加入3.6N硫酸5毫升以終止酶活性，作為空白測(cè)定。然后將各瓶放在25C水浴中保溫5min，向各瓶準(zhǔn)確加入5毫升0.1N過氧化氫，搖勻并記錄加入時(shí)間，將各瓶仍放在20C水浴中讓酶作用5分鐘后；再依次向1、2號(hào)瓶加入5毫升3.6N硫酸，然后向四個(gè)瓶中各加入1毫升20%KI，3滴鉬酸銨,用0.1mol/l硫代硫酸鈉滴定至淡黃色消失后，加入2滴淀粉指示劑，再用0.1mol/l硫代硫酸鈉滴定至藍(lán)色消失，記錄硫代硫酸鈉消耗量。3過氧化氫酶活性的計(jì)算：從空白滴定值減去樣品滴定值，即可求出此期間被酶所分解的過氧化氫量。被分解H2O2量（mg）=空白滴定值（ml）-樣品滴定值（ml）*代硫酸鈉濃度（N）*17過氧化氫酶活性被分解H2O2量（mg）/測(cè)定時(shí)用酶液（ml）*酶液總體積（ml）/樣品重（g）/時(shí)間（min）（五）注意事項(xiàng)1、 三角瓶、容量瓶等務(wù)必要清洗干凈。2、 研磨時(shí)CaCO3不要加得太多，大半匙即可，且要灑均勻。3、 過濾時(shí)不必全部過濾完，有20ml濾液即可。4、 把握好實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，不拖延時(shí)間，以免酶液失活。5、 滴定時(shí)速度不要過快，以免過量（最快不要超過1秒/滴）。最佳終點(diǎn)為最后半滴加入后藍(lán)色消失。6、 每次滴定起點(diǎn)一致，都從零開始。7、 左手操縱活塞，右手搖三角瓶，溶液要搖成漩渦狀。8、為了保證實(shí)驗(yàn)的平行性，四個(gè)三角瓶里所加的試劑應(yīng)該來自同組藥品，中途不要試劑瓶（使用別組藥品）。（六）常識(shí)1、加入過氧化氫之前為什么要保溫平衡？答：為了使三角瓶中的溶液溫度達(dá)到過氧化氫酶的最適酶促反應(yīng)溫度。過氧化氫酶的酶促反應(yīng)最適溫度為2025，受實(shí)驗(yàn)室條件限制，如果室溫在這個(gè)范圍內(nèi)則不進(jìn)行水浴，在空氣中保溫。2、為什么有個(gè)別組在加入KI溶液后有黑色沉淀出現(xiàn)？答：因?yàn)镵I溶液放置時(shí)間過長(zhǎng)易被空氣中的氧氣所氧化，出現(xiàn)單質(zhì)I2，這樣再加上被過氧化氫所氧化而得的I2，就可能在三角瓶中出現(xiàn)單質(zhì)I2過飽和，從而析出變成沉淀。遇到這種情況應(yīng)該更換KI溶液重做。3、為什么不能用NaOH代替H2SO4終止酶活性？答：H2SO4除了利用強(qiáng)酸性終止酶活外還參與氧化還原反應(yīng)，參與KI生成I2的氧化還原反應(yīng); NaOH雖然有強(qiáng)堿性可以終止酶活，但不能參這個(gè)反應(yīng)，這樣無法測(cè)出過氧化氫的量4.CAT的測(cè)定方法試劑配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O21ml H2O2定容至100ml方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）為空白把A240調(diào)零(2)50ul酶液3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）0.2ml 0.3% H2O2迅速顛倒混勻，開始計(jì)時(shí)1min后在240nm下比色，1次/1min(連續(xù)讀取5min)122 CAT提取方法方法 ：按文獻(xiàn)3i己述的方法。取花瓣100 g，加入少量石英砂、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，及i00 mg的CaCO3、2O0 mL水，冰浴研磨；用50 molL pH 70的磷酸緩沖液定容至10 mL；過濾；取濾液1O0 mL，稀釋lO、i00、200、500、1 000、2 000倍。此為CAT粗酶提取液。方法 ：按文獻(xiàn)4記述的方法。取花瓣0500 g， 加入10lL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10的PVP， 及少量石英砂、2 mmolL的EDTA、25 mmolL的DTT、體積分?jǐn)?shù)05的 一巰基乙醇，冰浴研磨；6 000 rmin、4cC離心20 min；取上清液，稀釋10、100、200、500、1 000、2 000倍。此為CAT粗酶提取液。123 CAT 活性測(cè)定方法方法 ：文獻(xiàn)1記述的碘量滴定法。碘量法利用H20z能將KI中的I一氧化，生成Iz， 以淀粉作為滴定終點(diǎn)指示劑，用硫代硫酸鈉滴定，計(jì)算出生成Iz的量，再換算成所消耗Hz0z的量。方法 ：文獻(xiàn)3記述的紫外分光光度碘量法。該方法利用I 在波長(zhǎng)350 nm處有一個(gè)吸收高峰， 吸光度與I 的含量成正比來計(jì)算生成Iz的量。用UV一120光度計(jì)測(cè)定樣品對(duì)波長(zhǎng)為350 nm光線的吸光度(OD值，用“0D350” 表示)。方法 ：直接紫外分光光度法。該方法利用H2oz在波長(zhǎng)294 nm處有一個(gè)吸收高峰4，吸光度與lH20 含量成正比來計(jì)算。取CAT粗酶提取液100 mL， 加入30molL的H202 200lL，迅速混勻，用UV一120光度計(jì)測(cè)定反應(yīng)開始后4 min內(nèi)對(duì)波長(zhǎng)294 nm光線的吸光度(用“OD 表示)的數(shù)值變化AOD2g4。以100 mL CAT粗酶提取液與200mL H20的混合液為空白對(duì)照。CAT與H202反應(yīng)只在前5 min內(nèi)呈線性關(guān)系， 因此要在酶加底物后的30 S內(nèi)讀出原始讀數(shù)。124 數(shù)據(jù)分析方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用國(guó)際通用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 612進(jìn)行分析。利用外標(biāo)法測(cè)定CAT活性。即配制濃度為0、1、5、10、15、20 pnolL 的H202標(biāo)準(zhǔn)溶液；取2o0lL各種濃度的H20 溶液，各加入100lL用方法提取的CAT酶的100倍稀釋液，反應(yīng)4 min后測(cè)定CAT活性；用300IL水調(diào)0。結(jié)果如表3。-測(cè)定切花中過氧化氫酶活性的3種常用方法的比較、陳曉敏 (華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 海南儋州 571737)方法二 過氧化氫酶的活力測(cè)定紫外吸收法H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活力。三、材料、儀器與試劑（一）、材料：小麥葉片（二）、儀器（儀器的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定）紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水??； （三）、試劑（試劑的選擇在實(shí)驗(yàn)開始前由學(xué)生在預(yù)習(xí)報(bào)告中提出方案后教師審定后并配制）0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。四、實(shí)驗(yàn)操作：1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管 號(hào)S0S1S2粗酶液(ml)0.2（煮死酶液）0.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.025預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活力。五、計(jì)算以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。 過氧化氫酶活力(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測(cè)定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。六、注意事項(xiàng)凡在240nm下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)有干擾。七、思考題1.影響過氧化氫酶活力測(cè)定的因素有哪些?2.過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)?三、過氧化氫酶的活性測(cè)定紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性?！緝x器與用具】 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml容量瓶1個(gè)；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水??；【試劑】0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定）。 【方法】 1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5下保存?zhèn)溆谩?.測(cè)定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測(cè)定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測(cè)定H2O2樣品液配置表管 號(hào)S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸餾水(ml)1.01.01.0 25預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測(cè)定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測(cè)4min，待3支管全部測(cè)定完后，按下式計(jì)算酶活性。 3.結(jié)果計(jì)算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。 過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測(cè)定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個(gè)酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間（min）。過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】植物體內(nèi)的黃素氧化酶類代謝產(chǎn)物常包含H202 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H202的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是清除H202的重要保護(hù)酶，能將H202分解為02和H20,從而使機(jī)體免受H202的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。(CAT)催化如下反應(yīng)：2 H2022 H20+ 02本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定H202的減少量來測(cè)定CAT的活性。在H202存在條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物的含量來測(cè)定活性。【試劑藥品1.50m mol/l pH7.0的磷酸緩沖液2.0.3% H202: 吸0.5ml 30% H202 加入pH7.0的磷酸緩沖液至 50ml3.0.2% 愈創(chuàng)木酚 :秤0.2g愈創(chuàng)木酚加入pH7.0的磷酸緩沖液至 100ml【實(shí)驗(yàn)步驟】酶液的制備1.稱取葉片 0.25g ，加入5倍量的（M/V）pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min離心15min取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。2. CAT活性的測(cè)定在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H202 1ml, H20 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)240nm處的OD降低速度。將每分鐘OD減少0.01定義為1個(gè)活力單位。3. POD活性的測(cè)定在3ml的反應(yīng)體系中，包括0.3% H202 1ml, .0.2% 愈創(chuàng)木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄470nm處OD增加速度。將每分鐘OD增加0.01定義為1個(gè)活力單位。4. 用考馬斯亮藍(lán) G-250法測(cè)定蛋白含量.【實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算】CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。參照J(rèn)iang和Zhang（2001，2002）的方法，取約0.2克材料置液氮中研磨成粉。6mL提取液（50 mmol L-1 Na2HPO4-