GB 15193.9-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)

書書書犌犅前言本標(biāo)準(zhǔn)代替顯性致死試驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)與相比，主要變化如下：標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)”；增加了術(shù)語和定義；修改了試驗(yàn)?zāi)康暮驮?；修改了試?yàn)方法；修改了數(shù)據(jù)處理；增加了試驗(yàn)報(bào)告；增加了試驗(yàn)的解釋。犌犅食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)的基本試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于評價(jià)受試物的致突變作用。術(shù)語和定義顯性致死突變發(fā)生于生殖細(xì)胞的一種染色體畸變，這種遺傳上的結(jié)構(gòu)或數(shù)目改變并不引起生殖細(xì)胞（精子或卵子）的機(jī)能障礙，而是直接造成受精卵或發(fā)育期胚胎的死亡。試驗(yàn)?zāi)康暮驮盹@性致死試驗(yàn)是檢測受試物誘發(fā)哺乳動物生殖細(xì)胞遺傳毒性的試驗(yàn)方法，其觀察終點(diǎn)為顯性致死突變。致突變物可引起哺乳動物生殖細(xì)胞染色體畸變，以致不能與異性生殖細(xì)胞結(jié)合或?qū)е率芫言谥睬八劳?，或?qū)е屡咛ピ缙谒劳?。一般以受試物處理雄性嚙齒類動物，然后與雌性動物交配，按照順次的周期對不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞進(jìn)行檢測，經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間后，處死雌性動物檢查子宮內(nèi)容物，確定著床數(shù)、活胚胎數(shù)和死亡胚胎數(shù)。如果處理組死亡胚胎數(shù)增加或活胚胎數(shù)減少，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈劑量反應(yīng)關(guān)系或試驗(yàn)結(jié)果能夠重復(fù)者，則可認(rèn)為該受試物為哺乳動物生殖細(xì)胞的致突變物。試驗(yàn)方法受試物受試物的配制：受試物應(yīng)溶解或懸浮于合適的溶媒中，溶媒應(yīng)為無毒物質(zhì)，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。首選溶媒為水，脂溶性的受試物可使用食用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液，不能配制成混懸液時(shí)，還可配制成如糊狀物的其他形式。一般情況下受試物應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲存穩(wěn)定者除外。給予途徑：應(yīng)采用灌胃法，或用喂飼法，小鼠常用灌胃體積為體重體重，大鼠常用灌胃體積為體重。陽性對照物也可采用腹腔注射的方法，注射體積為體重體重。給予受試物的方式：一般采用每天次、連續(xù)的給予方式。如果認(rèn)為其他方式合理的也可采用，如一次性或連續(xù)個(gè)月給予受試物。實(shí)驗(yàn)動物動物品系與級別：動物品系應(yīng)選擇顯性致死本底值低、受孕率高且著床數(shù)多、經(jīng)生殖能力預(yù)試受孕率在以上者，推薦使用小鼠或大鼠。實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)符合和的有關(guān)規(guī)定且有質(zhì)量犌犅合格證，健康的雄性成年小鼠（性成熟，周齡周齡，或體重以上），或大鼠（性成熟，周齡周齡，或體重以上）。交配用的成年雌鼠，應(yīng)該是未曾有過交配和生育史者，不同交配周期的雌鼠周齡、體重應(yīng)相近似。動物數(shù)量：應(yīng)使用適當(dāng)數(shù)目的雄性動物，雄鼠的數(shù)目應(yīng)足以使每個(gè)交配周期每組產(chǎn)生只只受孕雌鼠。每組雄鼠應(yīng)不少于只。動物飼養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件應(yīng)符合、飲用水應(yīng)符合、飼料應(yīng)符合的有關(guān)規(guī)定。劑量試驗(yàn)至少設(shè)個(gè)受試物劑量組，高劑量組應(yīng)能引起動物出現(xiàn)某些毒性體征，如生育力輕度下降，高劑量組受試物劑量可在之間。急性毒性試驗(yàn)給予受試物最大耐受劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）求不出時(shí)，則以體重、或人體可能攝入量的倍、或受試物最大給予劑量為最高劑量，然后在此劑量下再設(shè)個(gè)劑量組。一般應(yīng)同時(shí)做陽性和陰性（溶媒）對照組，如果同一實(shí)驗(yàn)室最近個(gè)月內(nèi)陽性對照組巳獲得陽性結(jié)果，且實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件和動物品系沒有變化，則可不再設(shè)陽性對照組。陽性對照物常選用環(huán)磷酰胺（），體重體重，腹腔注射，每天次，連續(xù)；其他還可選用三亞乙基密胺（）、甲基磺酸乙酯（）、甲基磺酸甲酯（）等。試驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)交配：給予雄鼠受試物后次日（一次染毒法），或末次給予雄鼠受試物后次日（多次染毒法），雄鼠與雌鼠按或比例同籠交配后，或根據(jù)陰道精子、陰栓檢查確定交配成功后，取出雌鼠另行飼養(yǎng)。間隔后，雄鼠以同樣比例再與另一批雌鼠同籠交配，小鼠如此進(jìn)行批批，大鼠批批。胚胎檢查：以雄鼠與雌鼠同籠日期算起第天第天，處死雌鼠后，剖腹取出子宮，檢查并記錄每一雌鼠的活胚胎數(shù)、早期死亡胚胎數(shù)與晚期死亡胚胎數(shù)。胚胎存活或死亡的鑒別方法如下：活胎：完整成形，色鮮紅，有自然運(yùn)動，機(jī)械刺激后有運(yùn)動反應(yīng)。早期死亡胚胎：胚胎形體較小，外形不完整，胎盤較小或不明顯。最早期死亡胚胎會在子宮內(nèi)膜上隆起一小瘤。如已完全被吸收，僅在子宮內(nèi)膜上留一隆起暗褐色點(diǎn)狀物。晚期死亡胚胎：成形，色澤暗淡，無自然運(yùn)動，機(jī)械刺激后無運(yùn)動反應(yīng)。數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價(jià)數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析方法顯性致死試驗(yàn)的檢查結(jié)果，以試驗(yàn)組為單位分別計(jì)算每個(gè)交配周期的下列指標(biāo)。按試驗(yàn)組與對照組動物的各項(xiàng)指標(biāo)分別采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析方法，如檢驗(yàn)、單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)等，以評定受試物的致突變性。受孕率可用檢驗(yàn)，平均著床數(shù)、平均死亡胚胎數(shù)可用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)法，胚胎死亡率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)。生育能力指標(biāo)生育能力指標(biāo)按式（）式（）計(jì)算：犌犅受孕率受孕雌鼠數(shù)交配雌鼠數(shù)（）總著床數(shù)活胚胎數(shù)早期死亡胚胎數(shù)晚期死亡胚胎數(shù)（）平均著床數(shù)總著床數(shù)受孕雌鼠數(shù)（）顯性致死指標(biāo)顯性致死指標(biāo)按式（）式（）計(jì)算：死亡胚胎數(shù)早期死亡胚胎數(shù)晚期死亡胚胎數(shù)（）胚胎死亡率死亡胚胎數(shù)總著床數(shù)（）平均死亡胚胎數(shù)死亡胚胎數(shù)受孕雌鼠數(shù)（）結(jié)果評價(jià)主要依據(jù)顯性致死指標(biāo)的結(jié)果進(jìn)行判定：）試驗(yàn)組與對照組相比較，胚胎死亡率（）和（或）平均死亡胚胎數(shù)明顯高于對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，即可確認(rèn)為陽性結(jié)果。）若統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果能重復(fù)者可確定為陽性。與此同時(shí)，應(yīng)在綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上做出最終評價(jià)。試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)名稱、試驗(yàn)單位名稱和聯(lián)系方式、報(bào)告編號。試驗(yàn)委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗(yàn)開始和結(jié)束日期、試驗(yàn)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、試驗(yàn)單位技術(shù)負(fù)責(zé)人、簽發(fā)日期。試驗(yàn)摘要。受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標(biāo)識）、數(shù)量、前處理方法、溶媒。實(shí)驗(yàn)動物：物種、品系、級別、數(shù)量、年齡或體重、性別、來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號）、動物檢疫、適應(yīng)情況，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號），飼料來源（供應(yīng)商名稱、實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)許可證號）。試驗(yàn)方法：試驗(yàn)分組、每組動物數(shù)、陽性和陰性（溶媒）對照組，選擇劑量的原則或依據(jù)、劑量、受試物給予途徑及期限，試驗(yàn)周期、交配程序、確定是否交配成功的方法、動物處死時(shí)間、觀察指標(biāo)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。試驗(yàn)結(jié)果：以文字描述和表格逐項(xiàng)進(jìn)行匯總，包括中毒體征、妊娠情況、著床數(shù)、活胚胎數(shù)、死亡胚胎數(shù)及相關(guān)指標(biāo)（胚胎死亡率、平均死亡胚胎數(shù)），給出結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理方法。試驗(yàn)結(jié)論：根據(jù)觀察到的效應(yīng)和產(chǎn)生效應(yīng)的劑量