GB 15193.22-2014 食品安全國家標準 28天經(jīng)口毒性試驗

書書書中華人民共和國國家標準犌犅食品安全國家標準天經(jīng)口毒性試驗（報批稿）發(fā)布實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布書書書犌犅食品安全國家標準天經(jīng)口毒性試驗范圍本標準規(guī)定了實驗動物天經(jīng)口毒性試驗的基本試驗方法和技術(shù)要求。本標準適用于評價受試物的短期毒性作用。術(shù)語和定義重復劑量天經(jīng)口毒性實驗動物連續(xù)天經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應。未觀察到有害作用劑量通過動物試驗，以現(xiàn)有的技術(shù)手段和檢測指標未觀察到任何與受試物有關(guān)的毒性作用的最大劑量。最小觀察到有害作用劑量在規(guī)定的條件下，受試物引起實驗動物組織形態(tài)、功能、生長發(fā)育等有害效應的最小作用劑量。靶器官實驗動物出現(xiàn)由受試物引起明顯毒性作用的器官。衛(wèi)星組在毒性研究設計和實施中外加的動物組，其處理和飼養(yǎng)條件與主要研究的動物相似，用于試驗中期或試驗結(jié)束恢復期觀察和檢測，也可用于不包括在主要研究內(nèi)的其他指標及參數(shù)的觀察和檢測。試驗目的和原理確定在天內(nèi)經(jīng)口連續(xù)接觸受試物后引起的毒性效應，了解受試物劑量反應關(guān)系和毒作用靶器官，確定天經(jīng)口最小觀察到有害作用劑量（）和未觀察到有害作用劑量（），初步評價受試物經(jīng)口的安全性，并為下一步較長期毒性和慢性毒性試驗劑量、觀察指標、毒性終點的選擇提供依據(jù)。儀器和試劑儀器器械實驗室常用解剖器械、電子天平、生物顯微鏡、檢眼鏡、生化分析儀、血球分析儀、凝血分析儀、尿液分析儀、離心機、石蠟切片機等。犌犅試劑甲醛、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅、石蠟、血球分析儀稀釋劑、生化分析試劑、凝血分析試劑、尿液分析試劑等。試驗方法受試物受試物應使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應按照受試物處理原則對受試物進行適當處理。將受試物摻入飼料、飲用水或灌胃給予。實驗動物動物選擇實驗動物的選擇應符合和的有關(guān)規(guī)定。選擇已有資料證明對受試物敏感的物種和品系，一般嚙齒類動物首選大鼠，非嚙齒類動物首選犬（通常選用犬）。大鼠周齡推薦不超過周，體重。試驗開始時每個性別動物體重的差異不應超過平均體重的。每組動物數(shù)不少于只，雌雄各半；若計劃試驗結(jié)束做恢復期的觀察，應增加動物數(shù)（對照和高劑量增加衛(wèi)星組，每組只，雌雄各半）。犬應選用個月個月幼犬，試驗開始時每個性別動物體重差異不應超過平均體重的，每組動物數(shù)不少于只，雌雄各半；若計劃試驗結(jié)束做恢復期的觀察，應增加動物數(shù)（對照和高劑量增加衛(wèi)星組，每組只，雌雄各半）。對照組動物性別和數(shù)量應與受試物組相同。動物準備試驗前大鼠在實驗動物房至少應進行（犬）環(huán)境適應和檢疫觀察。動物飼養(yǎng)實驗動物飼養(yǎng)條件應符合、飲用水應符合、飼料應符合的有關(guān)規(guī)定。試驗期間動物自由飲水和攝食，推薦單籠飼養(yǎng)，大鼠也可按組分性別分籠群飼，每籠動物數(shù)（一般不超過只）應滿足實驗動物最低需要的空間，以不影響動物自由活動和觀察動物的體征為宜。試驗期間每組動物非試驗因素死亡率應小于，瀕死動物應盡可能進行血液生化指標檢測、大體解剖以及病理組織學檢查，每組生物標本損失率應小于。劑量分組試驗至少設個受試物劑量組，個陰性（溶媒）對照組，必要時增設未處理對照組。若試驗結(jié)束做恢復期觀察，對照和高劑量需增設衛(wèi)星組。對照組除不給受試物外，其余處理均同受試物劑量組。劑量設計原則上高劑量應使部分動物出現(xiàn)比較明顯的毒性反應，但不引起死亡；低劑量不宜出現(xiàn)任何觀察到毒效應（相當于），且高于人的實際接觸水平；中劑量介于兩者之間，可出現(xiàn)輕度的毒性效應，以得出。一般遞減劑量的組間距以倍倍為宜，如受試物劑量總跨度過大，可加設劑量組。試驗劑量的設計參考急性毒性劑量和人體實際攝入量進行。犌犅能求出的受試物，以的作為天經(jīng)口毒性試驗的最高劑量組，此百分比的選擇主要參考劑量反應曲線的斜率。然后在此劑量下設幾個劑量組，最低劑量組至少是人體預期攝入量的倍。求不出的受試物，試驗劑量應盡可能涵蓋人體預期攝入量倍的劑量，在不影響動物攝食及營養(yǎng)平衡前提下應盡量提高高劑量組的劑量。對于人體擬攝入量較大的受試物，高劑量組亦可以按最大給予量設計。試驗步驟和觀察指標受試物給予根據(jù)受試物的特性和試驗目的，選擇受試物摻入飼料、飲水或灌胃方式給予。若受試物影響動物適口性，應灌胃給予。受試物應連續(xù)給予天。受試物灌胃給予，要將受試物溶解或懸浮于合適的溶媒中，首選溶媒為水、不溶于水的受試物可使用植物油（如橄欖油、玉米油等），不溶于水或油的受試物亦可使用羧甲基纖維素、淀粉等配成混懸液或糊狀物等。受試物應現(xiàn)用現(xiàn)配，有資料表明其溶液或混懸液儲存穩(wěn)定者除外。應每日在同一時段灌胃次，每周稱體重次，根據(jù)體重調(diào)整灌胃體積。灌胃體積一般不超過體重，如為水溶液時，最大灌胃體積大鼠可達體重，犬體重；如為油性液體，灌胃體積應不超過體重；各組灌胃體積一致。受試物摻入飼料或飲水給予，要將受試物與飼料（或飲水）充分混勻并保證該受試物配制的穩(wěn)定性和均一性，以不影響動物攝食、營養(yǎng)平衡和飲水量為原則，受試物摻入飼料比例一般小于質(zhì)量分數(shù)，若超過時（最大不應超過），調(diào)整對照組飼料營養(yǎng)素水平（若受試物無熱量或營養(yǎng)成分，且添加比例大于時，對照組飼料應填充甲基纖維素等，摻入量等同高劑量），使其與受試物組飼料營養(yǎng)素水平保持一致，同時增設未處理對照組；亦可視受試物熱量或營養(yǎng)成分的狀況調(diào)整受試物劑量組飼料營養(yǎng)素水平，使其與對照組飼料營養(yǎng)素水平保持一致。受試物劑量單位是每千克體重所攝入受試物的毫克（或克）數(shù)，即體重（或體重），當受試物摻入飼料其劑量單位亦可表示為（或）飼料，摻入飲水則表示為水。受試物摻入飼料時，需將受試物劑量（體重）按動物每體重的攝食量折算為受試物飼料濃度（飼料），一般天經(jīng)口毒性試驗大鼠每日攝食量按體重折算。一般臨床觀察觀察期限為，若設恢復期觀察，動物應停止給予受試物后繼續(xù)觀察，以觀察受試物毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)效應。試驗期間至少每天觀察一次動物的一般臨床表現(xiàn)，并記錄動物出現(xiàn)中毒的體征、程度和持續(xù)時間及死亡情況。觀察內(nèi)容包括被毛、皮膚、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、自主活動（如：流淚、豎毛反應、瞳孔大小、異常呼吸）及行為表現(xiàn)（如：步態(tài)、姿勢、對處理的反應、有無強直性或陣攣性活動、刻板反應、反常行為等）。對體質(zhì)弱的動物應隔離，瀕死和死亡動物應及時解剖。體重和攝食及飲水消耗量每周記錄體重、攝食量，計算食物利用率；試驗結(jié)束時，計算動物體重增長量、總攝食量、總食物利用率。受試物經(jīng)飲水給予，應每日記錄飲水量。如受試物經(jīng)摻入飼料或飲水給予，應計算和報告受試物各劑量組實際攝入劑量。眼部檢查試驗前和試驗結(jié)束時，至少對高劑量組和對照組實驗動物進行眼部（角膜、球結(jié)膜、虹膜）檢查，犬用犌犅熒光素鈉進行檢查，若發(fā)現(xiàn)高劑量組動物有眼部變化，則應對所有動物進行檢查。血液學檢查大鼠試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）進行血液學指標測定；犬試驗前、試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）進行血液學指標測定。推薦指標為白細胞計數(shù)及分類（至少三分類）、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細胞壓積、血小板計數(shù)、凝血酶原時間（）、活化部分凝血活酶時間（）等。如果對血液系統(tǒng)有影響，應加測網(wǎng)織紅細胞、骨髓涂片細胞學檢查。血生化檢查大鼠試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）進行血液生化指標測定；犬試驗前、試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）進行血液生化指標測定，應空腹采血。測定指標應包括電解質(zhì)平衡、糖、脂和蛋白質(zhì)代謝、肝（細胞、膽管）腎功能等方面。至少包含丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（）、堿性磷酸酶（）、尿素（）、肌酐（）、血糖（）、總蛋白（）、白蛋白（）、總膽固醇（）、甘油三酯（）、氯、鉀、鈉指標。必要時可檢測鈣、磷、尿酸（）、膽堿酯酶、山梨醇脫氫酶、總膽汁酸（）、高鐵血紅蛋白、激素等指標。應根據(jù)受試物的毒作用特點或構(gòu)效關(guān)系增加檢測內(nèi)容。尿液檢查大鼠在試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）時進行尿液常規(guī)檢查，犬試驗前、試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）進行尿液常規(guī)檢查。包括尿蛋白、相對密度、葡萄糖和潛血等。若預期有毒反應指征，應增加尿液檢查的有關(guān)項目如尿沉渣鏡檢、細胞分析等。體溫、心電圖檢查犬試驗前、試驗結(jié)束、恢復期結(jié)束（衛(wèi)星組）應進行體溫、心電圖檢查。病理檢查大體解剖試驗結(jié)束時必須對所有動物進行大體檢查，包括體表、顱、胸、腹腔及其臟器，并稱心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸的絕對重量，計算相對重量（臟體比值）。組織病理學檢查可以先對最高劑量組和對照組動物進行以下臟器組織病理學檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組相應器官及組織進行檢查。檢測臟器應包括腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、脾、腎、腎上腺、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、睪丸、膀胱，必要時可加測脊髓（頸、胸、腰）、垂體、食道、空腸、回腸、直腸、唾液腺、頸淋巴結(jié)、氣管、肺、動脈、子宮、乳腺、附睪、前列腺、骨和骨髓、坐骨神經(jīng)和肌肉、皮膚和眼球等組織器官。對肉眼可見的病變或可疑病變組織進行病理組織學檢查，出具組織病理學檢查報告，病變組織給出病理組織學照片。其他指標必要時，根據(jù)受試物的性質(zhì)及所觀察的毒性反應，增加其他指標（如神經(jīng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌毒性指標）。犌犅數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評價數(shù)據(jù)處理應將所有的數(shù)據(jù)和結(jié)果以表格形式進行總結(jié)，列出各組開始前的動物數(shù)、試驗期間動物死亡數(shù)及死亡時間、出現(xiàn)毒性反應的動物數(shù)，列出所見的毒性反應，包括出現(xiàn)毒效應的時間、持續(xù)時間及程度。對計量資料給出均數(shù)、標準差。對動物體重、攝食量、飲水量（受試物經(jīng)飲水給予）、食物利用率、血液學檢查、血生化檢查、尿液檢查、臟器重量和臟體比值、病理檢查等結(jié)果應以適當?shù)姆椒ㄟM行統(tǒng)計學分析。一般情況，計量資料采用方差分析，進行多個試驗組與對照組之間均數(shù)比較，分類資料采用精確分布檢驗、卡方檢驗、秩和檢驗，等級資料采用分析、秩和檢驗等。結(jié)果評價應將臨床觀察、生長發(fā)育情況、血液學檢查、血生化檢查、尿液檢查、大體解剖、臟器重量和臟體比值、病理組織學檢查等各項結(jié)果，結(jié)合統(tǒng)計結(jié)果進行綜合分析，初步判斷受試物毒作用特點、程度、靶器官、劑量效應、劑量反應關(guān)系，如設有恢復期衛(wèi)星組，還可判斷受試物毒作用的可逆性。在綜合分析的基礎得出天經(jīng)口毒性和（或）。初步評價受試物經(jīng)口的安全性，并為進一步的毒性試驗提供依據(jù)。試驗報告試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號。試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。試驗開始和結(jié)束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術(shù)負責人、簽發(fā)日期。試驗摘要。受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標識）、數(shù)量、前處理方法、溶媒。實驗動物：物種、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應商名稱、實驗動物生產(chǎn)許可證號），動物檢疫、適應情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實驗動物設施使用許可證號），飼料來源（供應商名稱、實驗動物飼料生產(chǎn)許可證號）。試驗方法：試驗分組、每組動物數(shù)、劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、觀察指標、統(tǒng)計學方法。試驗結(jié)果：動物生長活動情況、毒性反應特征（包括出現(xiàn)的時間和轉(zhuǎn)歸）、體重增長、攝食量、