生物化學(xué)蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)PPT課件

.,1,Biochemistry生物化學(xué),.,2,第4章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu),一、蛋白質(zhì)通論二、肽三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能五、肽和蛋白質(zhì)的人工合成,(Covalentstructureofprotein),.,3,一、蛋白質(zhì)通論,蛋白質(zhì)的化學(xué)組成,碳50%氫7%氧23%氮16%硫03%其它（P、Fe、Cu、I、Zn、Mo、Mn、Ca等）,.,4,定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,氮為蛋白質(zhì)的特征元素，將提取并純化的蛋白質(zhì)用凱氏定氮法測(cè)定氮的含量，然后通過下列公式可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量：蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=蛋白氮（mg/ml）6.25（或=蛋白氮（mg/ml）16%）,.,5,蛋白質(zhì)的分類,僅由氨基酸縮合而成，不含其它成分的蛋白質(zhì)叫單純蛋白質(zhì)（simpleprotein）；還含有其它成分的蛋白質(zhì)叫綴合蛋白質(zhì)（conjugatedprotein），綴合蛋白質(zhì)中的非蛋白質(zhì)成分叫配體（ligand），有些配體與蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵結(jié)合，有些通過非共價(jià)鍵結(jié)合。,.,6,蛋白質(zhì)的分類,蛋白質(zhì)還可以：按溶解性質(zhì)分類（見P158表4-1）按所含配體種類分類（見P158表4-2）按生物學(xué)功能分類（見P158表4-3）,.,7,蛋白質(zhì)的形狀,纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)膜結(jié)合蛋白質(zhì),CollagenMyoglobinBacteriorhodopsin,.,8,蛋白質(zhì)的大小,.,9,蛋白質(zhì)的大小,蛋白質(zhì)的分子量很大，并且分布范圍也很大，一般在大約60001106道爾頓。蛋白質(zhì)的分子量主要由組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的數(shù)目決定，對(duì)于綴合蛋白質(zhì)來說，有些配體也在蛋白質(zhì)的分子量中占有很大的比重。蛋白質(zhì)的分子量范圍是人為規(guī)定的，更小的氨基酸縮合物叫做肽。,.,10,蛋白質(zhì)氨基酸殘基數(shù)的估計(jì),對(duì)于簡單蛋白質(zhì)，用110除它的相對(duì)分子量即可約略估計(jì)出其氨基酸殘基數(shù)目。20種常見氨基酸的平均分子量為138組成蛋白質(zhì)的氨基酸的平均分子量為128每個(gè)氨基酸殘基的平均分子量為110,.,11,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次,一級(jí)結(jié)構(gòu)指的是多肽鏈的氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是多肽鏈借助于氫鍵排列成有規(guī)律的、局部的結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象四級(jí)結(jié)構(gòu)指的是寡聚蛋白質(zhì)亞基間的結(jié)合，亞基間不同的排列方式會(huì)形成不同的構(gòu)象。,.,12,Lys-Cys-Phe-Ala-Ile-Glu-Cys-Leu,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),SS,N端,C端,.,13,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu),“Shorthand”-helix“Shorthand”-strand,.,14,蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),Chymotrypsinspace-fillingmodelChymotrypsinribbon,.,15,蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),.,16,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu),在肽鏈內(nèi)或肽鏈間有時(shí)也有兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵的連接。,.,17,蛋白質(zhì)功能的多樣性,1催化；2調(diào)節(jié)；3轉(zhuǎn)運(yùn)；4貯存；5運(yùn)動(dòng)；6結(jié)構(gòu)成分；7支架作用；8防御和進(jìn)攻；9異常功能。,.,18,二、肽,肽的命名,肽是兩個(gè)至數(shù)百個(gè)氨基酸之間由肽鍵連接而成的線狀聚合物。根據(jù)形成肽的氨基酸數(shù)目，一般氨基酸數(shù)目在12個(gè)以內(nèi)時(shí)，稱為二肽、三肽、四肽等；13個(gè)至20個(gè)時(shí)稱為寡肽（oligopeptide）；20個(gè)以上稱為多肽（polypeptide）。當(dāng)分子量大到一定程度時(shí)，就稱為蛋白質(zhì)。寡肽和多肽的區(qū)分完全是人為規(guī)定的，其間的界限并不嚴(yán)格。肽鏈中的氨基酸因缺少了一分子水，叫做氨基酸殘基。,.,19,肽的兩端,一條肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?，肽鏈的一端具有游離的氨基，稱其為N端；另一端具有游離的羧基，稱其為C端。有少數(shù)小分子量的肽，其首尾也縮合成肽鍵，成為環(huán)肽。,.,20,肽的命名,對(duì)于小分子量的肽的命名，是從其N端開始，稱為某氨酰某氨酰某氨酰某氨基酸，下例寫成Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu，左邊是N端，右邊是C端。,.,21,肽的命名,對(duì)于生物體內(nèi)的具有特定結(jié)構(gòu)和功能的小分子量肽，還有特別名稱，如腦啡肽、內(nèi)啡肽、催產(chǎn)素、加壓素等。,.,22,肽基的C、O和N原子間的共振相互作用,.,23,肽鍵共振的結(jié)果,限制肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)，給肽主鏈的每一個(gè)氨基酸殘基只保留兩個(gè)自由度。組成肽基的4個(gè)原子和2個(gè)相鄰的C原子傾,向于共平面，形成所謂的多肽主鏈的酰胺平面（amideplane）或稱肽平面（peptideplane）。,肽平面,.,24,肽鍵共振的結(jié)果,CN鍵的長度為0.133nm，比正常的CN單鍵（0.145nm）短，但比典型的C=N鍵（0.125nm）長。估計(jì)肽基中的CN鍵具有約40%的雙鍵性質(zhì)，而C=O鍵具有40%的單鍵性質(zhì)，在室溫下足以防止CN鍵旋轉(zhuǎn)。雜化的中間態(tài)酰胺帶有0.28個(gè)凈正電荷，羰基帶有0.28個(gè)凈負(fù)電荷，肽鍵具有永久偶極。,.,25,肽基的順、反構(gòu)型,肽平面內(nèi)，兩個(gè)C可以處于順式或反式構(gòu)型。因?yàn)轫樖綐?gòu)型兩個(gè)R基有空間位阻，所以反式構(gòu)型比順式構(gòu)型穩(wěn)定，因此肽鏈中肽鍵幾乎都是反式構(gòu)型。,.,26,脯氨酸的亞氨基形成的肽鍵,OfthepeptidebondsbetweenaminoacidresiduesotherthanPro,over99.95%areinthetransconfiguration.Forpeptidebondsinvolvingtheiminonitrogenofproline,however,about6%areinthecisconfiguration;manyoftheseoccuratturns.,transcis,.,27,肽的物理化學(xué)性質(zhì),由于短肽晶體的熔點(diǎn)都很高，說明短肽的晶體是離子晶格，在水溶液中以偶極離子存在。在pH014范圍內(nèi)，肽鍵中的酰胺氫不解離，所以肽的酸堿性主要決定于肽鏈末端的羧基、氨基以及R基團(tuán)上的可解離基團(tuán)。因?yàn)殡逆溎┒说聂然桶被嗑嗪苓h(yuǎn)，它們之間的靜電引力較弱，所以它們的酸堿性比氨基酸的羧基和氨基弱。R基上可解離基團(tuán)的解離常數(shù)也有所變化。在某一pH下，肽中各可解離基團(tuán)解離得到的凈電荷為0，這個(gè)pH就是該肽的等電點(diǎn)。,.,28,肽的物理化學(xué)性質(zhì),肽的化學(xué)反應(yīng)和氨基酸的一致。N端的氨基酸殘基也可以與茚三酮反應(yīng)，這一反應(yīng)可用于肽的定性和定量測(cè)定。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的，氨基酸沒有此反應(yīng)。一般含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物與CuSO4堿性溶液都能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物，利用這個(gè)反應(yīng)可以用分光光度法（540nm）測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。,.,29,雙縮脲與肽的結(jié)構(gòu)比較,雙縮脲,三肽,.,30,三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,蛋白質(zhì)測(cè)序的策略,首先要得到較純的蛋白質(zhì)樣品，純度應(yīng)在97%以上。測(cè)出它的分子量。分析蛋白質(zhì)中是否有非肽成分。測(cè)定蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈的數(shù)目。拆分多肽鏈。測(cè)定肽鏈的氨基酸組成。鑒定肽鏈的C末端氨基酸及N末端氨基酸。,.,31,蛋白質(zhì)測(cè)序的策略,酶水解肽鏈成短的肽段。采用兩套以上的酶水解方法，得到互相重疊的肽段。分離純化這些肽段，并鑒定各肽段的C末端氨基酸及N末端氨基酸。測(cè)定各肽段的序列。確定天冬酰胺、谷氨酰胺以及鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的位置。拼出完整肽鏈的序列。,.,32,N末端分析,二硝基氟苯法（DNFB法）：用DNFB（Sanger試劑）與肽鏈N末端的氨基反應(yīng)，生成DNP多肽或DNP蛋白質(zhì)。然后水解肽鏈，分離得到DNP氨基酸，紙層析、薄層層析或HPLC分離鑒定。丹磺酰氯法（DNS法）：與DNFB法類似，由于丹磺酰氯有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍。,DNP-氨基酸,.,33,N末端分析,苯異硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽鏈與PITC（Edman試劑）反應(yīng)生成PTC多肽（苯氨基硫甲酰多肽）或PTC蛋白質(zhì)，在酸性有機(jī)溶劑中加熱時(shí)，N末端的PTC氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并從肽鏈上脫落下來，除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的。分離PTH氨基酸并鑒定。肽鏈可用于鑒定下一個(gè)氨基酸，所以此法可以用于測(cè)序。氨肽酶法：根據(jù)游離氨基酸出現(xiàn)的時(shí)間順序分析N末端氨基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有時(shí)難以分析。,PTH-氨基酸,.,34,C末端分析,肼解法：蛋白質(zhì)或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解。反應(yīng)中除C末端氨基酸以游離形式存在外，其它氨基酸都轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基酸酰肼。反應(yīng)中生成的氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游離的C末端氨基酸借助DNFB法或DNS法鑒定。肼解過程中，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破壞不易測(cè)出，精氨酸轉(zhuǎn)變成鳥氨酸。,.,35,肼解法反應(yīng)式,.,36,C末端分析,還原法：肽鏈C末端的氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的氨基醇，肽鏈水解后層析鑒定。,.,37,C末端分析,羧肽酶法：目前常用的有4種羧肽酶：A、B、C和Y。羧肽酶A能釋放除Pro、Arg和Lys之外的任何一種C末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以堿性氨基酸Arg和Lys為C末端的氨基酸；羧肽酶C和Y可以釋放任何一種C末端氨基酸。,-Val-Ser-Gly,.,38,二硫橋的斷裂,先加8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，再用氧化法或還原法斷裂二硫鍵。還原法產(chǎn)生的巰基要用烷基化試劑如碘乙酸保護(hù)起來，以免重新形成二硫鍵。,碘乙酸保護(hù),.,39,還原法斷裂二硫橋,.,40,氧化法斷裂二硫橋,過甲酸,.,41,氨基酸組成的分析,酸水解分析除色氨酸外的其它氨基酸，堿水解分析色氨酸。為了準(zhǔn)確分析酸水解中被部分破壞的Ser、Thr、Tyr、Cys的量，酸水解24、48、72小時(shí)后，分析這些氨基酸的量，然后外推至0時(shí)得到這些氨基酸不被破壞時(shí)的量。分析酸水解液中NH3的量，得出有多少個(gè)Asn+Gln。氨基酸的分析：離子交換柱層析分離，茚三酮染色，比色定量。,.,42,某些氨基酸含量隨水解時(shí)間的變化,易被破壞的氨基酸采用外推法測(cè)定,疏水氨基酸難以水解，采用極限法測(cè)定,.,43,氨基酸分析儀示意圖,加熱,.,44,氨基酸分析儀示意圖,長柱用于分離酸性和中性氨基酸,短柱用于分離堿性氨基酸和氨,柱中填料為細(xì)粒聚苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂,.,45,氨基酸的離子交換柱層析圖譜,洗脫曲線,.,46,多肽鏈的部分裂解,酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶、梭菌蛋白酶等，它們各自有自己的水解專一性。蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）?；瘜W(xué)裂解法：溴化氰（只裂解由Met的羧基形成的肽鍵）、羥胺（裂解Asn-Gly之間的肽鍵，也能部分裂解Asn-Leu及Asn-Ala之間的肽鍵）。,.,47,蛋白酶的專一性,AECys,.,48,溴化氰裂解法,溴化氰只裂解由Met的羧基形成的肽鍵,.,49,肽段的分離純化,凝膠過濾凝膠電泳高效液相色譜,.,50,氨基酸序列測(cè)定,質(zhì)譜法：兩臺(tái)質(zhì)譜儀聯(lián)用，第一臺(tái)質(zhì)譜儀通過電噴射電離使肽段帶上電荷，將不同大小的肽段分離。第二臺(tái)質(zhì)譜儀分析肽段的序列。在第二臺(tái)質(zhì)譜儀上，小肽段在碰撞池中與氮?dú)夥肿踊驓鍤夥肿优鲎?，碎裂成依次少一個(gè)氨基酸殘基的碎片，分析這些碎片的質(zhì)量差，可得出序列。,.,51,串聯(lián)質(zhì)譜儀,.,52,串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序工作原理,分離肽段,測(cè)序,.,53,氨基酸序列測(cè)定,Edman降解法：由N端向C端逐步降解。先將被測(cè)肽段的羧基端固定到不溶性的樹脂上，便于分離切下的氨基酸和剩余的肽段。酶降解法：用外肽酶逐個(gè)切下氨基酸分析。只能分析很少的幾個(gè)氨基酸。根據(jù)核苷酸序列的推定法：找到該蛋白質(zhì)的基因，從基因的編碼序列按三聯(lián)密碼推出氨基酸序列。,.,54,所得資料：N-末端殘基HC-末端殘基S第一套肽段第二套肽段OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO借助重疊肽確定肽段次序：末端殘基HS末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推斷全序列HOWTOUSEOVERLAPS,肽段在多肽鏈中次序的決定,.,55,二硫橋位置的確定,在保留二硫橋的情況下對(duì)蛋白質(zhì)部分水解，利用對(duì)角線電泳可以鑒定出哪些肽段帶有二硫橋。對(duì)角線電泳是雙向電泳，把水解后的肽段混合物點(diǎn)到濾紙的中央，第一向?qū)㈦亩伟创笮『蛶щ姾汕闆r分離，然后把濾紙暴露到過甲酸蒸氣中，使二硫橋斷裂，再在同樣的條件下進(jìn)行第二向電泳。,.,56,對(duì)角線電泳,.,57,對(duì)角線電泳,.,58,二硫橋位置的確定,二硫橋連接的兩個(gè)肽段在第一向時(shí)是一個(gè)斑點(diǎn)，第二向時(shí)成了兩個(gè)斑點(diǎn)，并離開對(duì)角線。對(duì)這兩個(gè)斑點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的肽段進(jìn)行測(cè)序，如果兩個(gè)肽段中各只有一個(gè)Cys，它們就是參與二硫橋的Cys。根據(jù)這兩個(gè)肽段的序列，可知它們?cè)谡麄€(gè)肽鏈中的位置。,.,59,酰胺位置的確定,對(duì)肽鏈進(jìn)行各種部分水解，直到測(cè)得一個(gè)肽段中只有1個(gè)天冬酰胺或谷氨酰胺為止。,.,60,四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能,有些來源于不同生物的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種序列上的相似性叫做同源性。同源蛋白質(zhì)中有許多氨基酸殘基是相同的，稱為不變殘基，或保守性殘基，而在不同物種的同源蛋白質(zhì)中不同的氨基酸殘基稱為可變殘基。親緣關(guān)系越近的同源蛋白質(zhì)的同源性越強(qiáng)。同源蛋白質(zhì)往往在不同生物體中行使相同或相似的功能，例如各種脊椎動(dòng)物體內(nèi)的血紅蛋白就屬于同源蛋白質(zhì)。,.,61,細(xì)胞色素C,細(xì)胞色素C是一種含血紅素的蛋白質(zhì)，在線粒體中起電子傳遞的作用。大多數(shù)細(xì)胞色素C含一百,零幾個(gè)氨基酸殘基，40多個(gè)物種的細(xì)胞色素C氨基酸序列分析表明，有28個(gè)殘基是不變的，所有細(xì)胞色素C在第17位上都是一個(gè)Cys殘基，這個(gè)殘基是血紅素結(jié)合的部位。,.,62,細(xì)胞色素C的不變殘基,.,63,不同物種細(xì)胞色素C的差異殘基數(shù),.,64,根據(jù)細(xì)胞色素C建立的系統(tǒng)樹,哺乳類,鳥和爬蟲類,硬骨魚類,軟骨魚類,真菌,昆蟲,兩棲類,植物,.,65,氧合血紅素蛋白質(zhì),肌肉中的氧合血紅素蛋白質(zhì)肌紅蛋白（Myoglobin）由一條肽鏈組成，含153個(gè)氨基酸殘基，紅細(xì)胞中的血紅蛋白（Hemoglobin）是一個(gè)由兩條鏈（每條鏈141個(gè)氨基酸殘基）和兩條鏈（每條鏈146個(gè)氨基酸殘基）組成的四聚體蛋白。肌紅蛋白、血紅蛋白的鏈和鏈都是珠蛋白（globin），它們有很高的序列同源性，通過血紅素結(jié)合氧的能力都被這3種多肽鏈保留下來了。,.,66,氧合血紅素蛋白的進(jìn)化樹,.,67,絲氨酸蛋白酶類,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶以及纖溶酶都是絲氨酸蛋白酶，它們有足夠的序列同源性，在它們的活性中心都有絲氨酸，說明它們可能是由祖先絲氨酸蛋白酶進(jìn)化而來。,.,68,生物活性和來源差異很大的蛋白質(zhì),卵清中的溶菌酶（含129個(gè)殘基，水解細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分）和人乳汁中的-乳清蛋白（含123個(gè)殘基，調(diào)節(jié)乳糖合成）功能和來源