【基金標書】2010CB911900-免疫相關重要蛋白質的生物學研究

項目名稱： 免疫相關重要蛋白質的生物學研究 首席科學家： 張學敏 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 總后勤部衛(wèi)生部 一、研究內(nèi)容 針對免疫識別、免疫應答與免疫耐受的主要科學問題，研究從免疫細胞對抗原的識別至產(chǎn)生效應的整個過程所涉及免疫細胞（ T、 B、 系列蛋白質分子及其在免疫過程中的功能，從分子水平闡明機體產(chǎn)生各種正、負免疫應答的細節(jié)和關鍵點，不同應答效應及其調(diào)控的機制，進而掌握免疫過程及其調(diào)節(jié)的特點和規(guī)律。 1. 與免疫識別相關的蛋白質結構與功能研究。研究 現(xiàn)天然免疫 “ 泛特異性識別 ” 的生物學特點和結構信息證據(jù)，發(fā)現(xiàn)新的天然免疫識別受體（或新功能）；研究以 析 討自主發(fā)現(xiàn)的天然識別受體 2. 與免疫應答相關 的蛋白質結構與功能研究。揭示在腫瘤發(fā)生早期天然免疫效應細胞的活化及對腫瘤特應性免疫應答的激活作用及其作用的分子機理。探討 配體介導的腫瘤微環(huán)境是否集聚處女 定 究 胞與 析 作用于激活期還是效應期，闡明 析穿孔素及 “ 孤兒 ” 顆粒酶的晶體結構，闡明穿孔素和 “ 孤兒 ”顆粒酶在 析自主發(fā)現(xiàn) 過 討 細胞、 NK 3. 與免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受相關的蛋白質結構與功能研究。探討 15個自主發(fā)現(xiàn)的新分子以及 5個關注的分子在免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受中的作用和分子機制，研究不同的分子在不同細胞內(nèi)的表達調(diào)控模式，重點關注這些分子在 顧重要的分子在 細胞抗原受體 (的作用機制，同時研究這些分子在免疫調(diào)節(jié)中相互作用分子，并且建立動物模型，探討這 些分子在感染、抗原特異性免疫應答以及免疫耐受中的作用。 4. 參與免疫信號通路調(diào)控的蛋白質結構與功能研究。應用最新質譜技術等手段研究 導的 路激活過程中重要蛋白質復合體的形成及活化機制，并探討復合體關鍵組分對該通路的調(diào)控機制；深入研究 號通路的機制；深入研究 討 模型研究導致 二、預期目標 總體目標： 從我國蛋白質科學研究的重大需求以及挖掘重要免疫相關分子的結構、功能和作用機理等重大科學問題出發(fā)，建立基于蛋白質科學的免疫學研究新模式，即應用蛋白質及其復合體結構與功能研究的方法，深入發(fā)掘并解析免疫過程中新的蛋白質分子、相互作用網(wǎng)絡、泛素化等翻譯后修飾、結構特點及其定位規(guī)律，在免疫識別、免疫應答與耐受和免疫調(diào)節(jié)的分子機理研究上取得重要突破，為攻克感染、腫瘤或自身免疫疾病提供堅實的理論基 礎，為相應的干預治療提供新的策略和新的靶點。 五年預期目標 : 1、 通過質譜技術成功鑒定免疫識別、應答活化及調(diào)節(jié)過程中重要信號通路中的蛋白質復合體，發(fā)現(xiàn) 10外，揭示已有工作基礎的 15個免疫相關新蛋白質分子在免疫識別、免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受中的作用和分子機制，為免疫相關疾病的藥物研發(fā)提供 2 2、 較完整闡明 2現(xiàn)并解析 1個新的天然免疫受體調(diào)控蛋白的功能結構特征；解析 1個天然免疫識別受體的新結構或天然免疫 識別受體相關的復雜蛋白質結構；闡明 1個基于天然免疫識別受體的免疫突觸的形成結構和蛋白質組成。 3、 揭示在腫瘤發(fā)生早期天然免疫對獲得性免疫的激活作用機制，探明細胞毒性 示抗腫瘤免疫效應的功能與結構的關系，加深對免疫系統(tǒng)排斥腫瘤機理的認識。 4、 發(fā)表高水平研究論文 30篇以上，其中 0論文 3篇， 0論文 5篇。獲得一批高水平的擁有自主知識產(chǎn)權的技術成果，申請專利 10項以上。 5、 培養(yǎng)一批在免疫學和蛋白質科學領域具有國際競爭力的優(yōu)秀中青年科學家和后備人才；造 就一支跨學科、跨領域、精誠合作、團結奮進的科研隊伍。 三、研究方案 學術思 路 對 免疫識別 、 免疫應答 /耐受 、 免疫調(diào)節(jié)過程 中的 的極其復雜的免疫蛋白質系統(tǒng)，目前缺乏整體了解，特別是對 一些重要 蛋白質在空間和時間上的表達 、 修飾 、 定位，以及相互作用和在執(zhí)行功能上的相互關系了解甚少。 本項目 以免疫識別 耐受 以 有較好研究基礎的免疫細胞為主要模型 ， 通過蛋白質技術 發(fā)現(xiàn)新 的 免疫 相關蛋白質及其復合體， 解析結構信息，探討其在 免疫識別 、 免疫應答 /耐受 、 免疫調(diào)節(jié)過程 中的功能 ；分析 磷酸化、泛素化等翻譯后修飾 對其功能的影響， 并 揭示免疫 信號通路 的 調(diào)控 機制。 本項目還將深入研究已 自主發(fā)現(xiàn)的 系列 新分子以及 其它重要蛋白質 在免疫 過程 中的 功能 和機制 。 以上努力，使我們可能解決免疫學中一系列亟待突破的重要科學問題： 1） 天然免疫識別 “泛特異性 ”的生物學特點及 識別受體的 結構 與功能； 2） 天然免疫對獲得性免疫細胞活化的分子機理和抗腫瘤 分子機制 ; 3） 免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的分子機制，特別是免疫應答過程中的負向調(diào)節(jié)機制 ; 4）參與 免疫調(diào)節(jié) 重要信號通路的關鍵蛋白質發(fā)現(xiàn)與功能揭示。 這些重 要 免疫學科學問題的 研究一旦有所突破，將對人類疾病的防治帶來巨大益處。 技術途徑 1. 表達模式研究 ：所需使用的免疫細胞一方面使用既有細胞系，另一方面通過原代分離和體外培養(yǎng)產(chǎn)生。 2. 免疫細胞功能調(diào)節(jié)研究 3. 信號傳導通路研究 4. 相互作用分子研究 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 1. 選擇一批受體結構域基因片段進行克隆表達 ；進行 天然免疫識別相關蛋白的基因表達、蛋白純化和批量制備 。 2. 構建不具活性的穿孔素前體 ； 分離鑒定與 顆粒酶 K 相作用的底物 ；表達顆粒酶 H 和 M； 表達重組行結晶條件摸索和高質量結晶實驗，衍射分析 3. 初步完成所關注免疫分子在免疫識別以及免疫調(diào)節(jié)中的表達調(diào)控模式，完成一些重要表達載體的構建和鑒定以及一些細胞系的建立鑒定 。 4. 建立激活信號轉導通路細胞模型 ；觀察 活信號 通路 的動態(tài)變化過程情況 ； 研究 相互作用及其動態(tài)變化 ；分析 酸化水平調(diào)控以及激酶活性。 5. 探討 徑發(fā)揮抑制作用所依賴的關鍵 結構域和關鍵氨基酸 ； 探討 互作用 的結構基礎和調(diào)控機制 ； 檢測 1. 建立天然免疫受體表達的研究平臺和相關技術； 1 2. 表達具生物活性的穿孔素及其功能片段 ； 分離鑒定顆粒酶 K 的作用底物 ； 確定 的結構模型。 3. 完成 10建原核和真核等表達載體30立穩(wěn)定干擾或過表達細胞系 20 4. 建立 活信號轉導通路細胞模型 ； 明確 5. 明確 揮作用的結構基礎 ；明確 互作用 的結構基礎和調(diào)控機制 ； 明確 6. 發(fā)表 第 二 年 1. 天然免疫識別相關蛋白的克隆、表達、純化、單抗制備； 初步 研究 以開展天然免疫識別相關蛋白受體 /配體的相互作用研究。 2. 解析穿孔素及其功能片段的結構 ；1. 獲得 1步獲得以 得 1個天然免疫受體蛋白微晶 。 2. 獲得穿孔素活性片段的晶體結 構；年度 研究內(nèi)容 預期目標 研究顆粒酶 對細胞的殺傷效應及殺傷機制 ； 探索顆粒酶 的結晶條件，進行晶體結構分析。 3. 檢測 細胞和 P 實驗，差異蛋白進行質譜鑒定。 4. 完成所關注免疫分子對免疫細胞生物學功能的影響，初步完成相關的信號傳導通路的研究 。 5. 檢 測 病毒及 :C)激活的 錄活性 、 響并進一步驗證 ； IB磷酸化水平以及蛋白質穩(wěn)定性的調(diào)控分析。 6. 檢測 制 徑關鍵結構基礎的結合蛋白 ； 探討 制 徑所依賴的關鍵結構域和關鍵氨基酸 ； 探討互作用在腫瘤和自身免疫病中的可能應用。 確定 顆粒酶 在 確定 和 胞的功能影響 ； 明確和 3. 完成 8免疫分子對樹突狀細胞、單核巨噬細胞以及其他免疫細胞的細胞因子分泌等基本免疫學功能的影響研究；完成 8免疫分子在免疫細胞內(nèi)在受到 處理后信號傳導通路 變化的檢測 。 4. 質譜鑒定刺激不同時間形成的 初步 明確 5. 揭示 徑抑制作用的機理 ； 明確 6. 發(fā)表 第 三 年 1. 摸索天然免疫識別相關蛋 白晶體生長條件；制備單抗和小分子靶點探針；驗證以 核心 突觸蛋白的核心成分并對其進行成像分析； 2. 天然免疫識別相關蛋白的突觸形成和 測定穿孔素對細胞的損傷作用 ； 分析線粒體膜通透性 、 活性氧自由基 、促凋亡因子 等 的 變化； 激活 用 過繼轉移到荷瘤鼠，分析這些細胞的增殖作用 ； 驗證 1. 力爭獲得 1 個能夠適合于 X 射線晶體衍射的晶體 ； 獲得 2點探針；明確核心的突觸蛋白的成分及其分布； 2. 研究穿孔素對漿膜及對線粒體的損傷作用 ； 確定 系； 明確和 3. 明確 8免疫分子的基本信號傳導通路，初步確立 6 4. 初步揭示 控 年度 研究內(nèi)容 預期目標 3. 檢測 和 通過 感染清除中的作用。 4. 驗證復合體成分 ； 檢測 酸化、二聚化以及入核能力的影響 ； 檢測 否參與調(diào)控 分析已知 控子在 酶活性中的作用模式。 5. 探討 達紊亂 與腫瘤和自身免疫病 發(fā)病機制 的關系； 探討 探討 5. 了解 達紊亂與腫瘤和自身免疫病發(fā)病機制的關系 ； 明確 明確 的 結構突變。 6. 發(fā)表 申請專利 1項。 第 四 年 1. 研究 2. 觀察穿孔素或 /和顆粒素 作用下，顆粒酶進入靶細胞的部位 ； 分析2胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生 ； 研究 利用 3. 建立相關重點關注基因的轉基因小鼠模型，初步探討所關注免疫分子在疾病模型中的作用以及其體內(nèi)介導免疫識別、免疫調(diào)節(jié)、免疫耐受的作用，驗證這些分子與相互作用分子的相互調(diào)節(jié) 。 4. 檢測 況； 研究 培養(yǎng)上清中病毒滴度變化的 影響； 分離原代巨噬細胞，檢測 培養(yǎng)上清中泌量的變化 ； 分1. 完成 1 個免疫受體蛋白的晶體結構測定，收集復合物晶體的衍射數(shù)據(jù)；初步明確 初步明確天然免疫識別相關蛋白在腫瘤免疫逃逸中作用； 2. 探明穿孔素如何介導顆粒酶進入腫瘤靶細胞 ； 明確 3. 建立 8基因小鼠動物模型，了解 4一步確認免疫分子的相互作用蛋白質和作用的效應和機制 。 4. 初步 闡明新的 合體成分的功能及其調(diào)控機制 ；初步 闡明控 年度 研究內(nèi)容 預期目標 析 腫瘤壞死因子誘導腫瘤細胞凋亡的調(diào)控 作用 。 5. 探討 途徑和 徑 的高水平活化。 5. 了解 達紊亂與腫瘤和自身免疫病發(fā)病機制的關系 ； 明確 達異常 與 促進途徑和 水平活化的 關系 。 6. 發(fā)表 文 5 ， 申請專利2第 五 年 1. 多個免疫受體蛋白及其復合物的晶體生長及解析；利用單抗、小分子靶點探針等研究受體 /配體的相互作用。 2. 研究 胞與 導的腫瘤細胞排斥 的關系； 分析