【基金標(biāo)書】2010CB912600-內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制

項(xiàng)目名稱： 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制 首席科學(xué)家： 朱依諄 復(fù)旦大學(xué) 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門： 教育部 上海市科委 一、研究?jī)?nèi)容 綜合應(yīng)用代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法和技術(shù)， 以 重要的心血管生理和病理調(diào)控通路 為 研究主要對(duì)象 ， 研究 硫化氫 與蛋白質(zhì) 靶分子的 相互作用 及其 機(jī)制 ；研究 硫化氫 對(duì) 蛋白之間 、 蛋白 質(zhì) 和 核酸之間 相互作用 的調(diào)節(jié)及其 機(jī) 制 。 闡明 心臟中內(nèi)源性硫化氫 在生理和病理情況下的生成代謝途徑，探討 硫化氫 的分解代謝過程。 1. 揭示若干 控跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通路；發(fā)現(xiàn)若干 接作用的靶分子；明確靶分子蛋白相互作用的分子機(jī)制。 2. 分離和驗(yàn)證 胞效應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡過程中信號(hào)通路中的重要蛋白因子，結(jié)合基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué) , 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示 胞效應(yīng)的分子機(jī)制和重要蛋白的作用機(jī)理和生物學(xué)功能。 3. 應(yīng)用獨(dú)創(chuàng)的半胱氨酸衍生物 作為分子探針，全面揭示含硫氨基酸體內(nèi)代謝的基本規(guī)律。篩選出與含硫氨基酸及探針?biāo)幬?心肌缺血保 護(hù)作用密切相關(guān) 蛋白分子，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，探尋含硫氨基酸及 探針?biāo)幬锷飳W(xué)效應(yīng)和代謝通路的機(jī)體內(nèi)源性拮抗劑和抑制劑，可能是具有臨床應(yīng)用前景的防治心血管疾病的新策略。 4. 闡明心臟中 徑和 徑的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及兩條途徑的協(xié)調(diào)機(jī)制。闡明生理?xiàng)l件和病理?xiàng)l件下表達(dá)調(diào)控的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和在體研究，同時(shí)對(duì)闡明 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也非常重要。闡明 膜傳遞及與氧化性小分子和金屬離子的反應(yīng)特性。 跨膜傳遞關(guān)系到內(nèi)源性 作用方式以及外源性 體作為藥物的可行 性；與氧化性小分子和與金屬離子的反應(yīng)特性則 與 分解代謝相關(guān)。 二、預(yù)期目標(biāo) （一）總體目標(biāo) 采用蛋白組學(xué) 和代謝組學(xué) 的經(jīng)典研究方法，結(jié)合心血管疾病的生理和病理過程，從細(xì)胞水平到整體水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。 以 缺血性心臟病 為核心， 探討 體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物 小分子氣體信號(hào) 心血管系統(tǒng)保護(hù)作用 的分子機(jī)制， 篩選分離出 特異的靶蛋白 、 目標(biāo) 基因和生物標(biāo)記物 ； 進(jìn)一步利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)，生物化學(xué)的方法研究蛋白之間，蛋白和 相互作用機(jī)理 。 全面 闡述 心臟中內(nèi)源性 生理和病理情況下的生成代謝途徑，以及生成的內(nèi)源性 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的傳遞過程以及傳遞過程中 與氧化性小分子（如 金屬離子的相互作用，從而探討 分解代謝過程。 （ 二 ） 五年預(yù)期 目標(biāo) 1. 闡明 細(xì)胞水平上的傳遞過程，探討 遞機(jī)制及傳遞過程中參與的反應(yīng)，如 氧化應(yīng)激蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的構(gòu)象和正常功能的影響 。該工作可能找到體內(nèi) 的作用靶分子，從而為最終闡明 心臟保護(hù)作用的機(jī)制 提供理論依據(jù) ； 2. 闡明 遞機(jī)制及傳遞過程中 蛋白之間，蛋白和 相互作用機(jī)理 ，為在哺乳動(dòng)物中揭示 2論依據(jù) ； 3. 細(xì)胞水 平和整體水平上研究?jī)?nèi)源性 生相關(guān)酶 應(yīng)激條件下（如氧化壓力）和病理狀態(tài)下表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，找到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及激活這些轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)通路和相關(guān)蛋白分子，為設(shè)計(jì)激活體內(nèi)內(nèi)源性 生的藥物打下基礎(chǔ)； 4. 培養(yǎng)一批國際一流心臟蛋白組學(xué)領(lǐng)域科研人員，培養(yǎng)一批高水平的中青年科學(xué)家，提高我國蛋白組學(xué)科研水平和自主創(chuàng)新能力，增強(qiáng)國際競(jìng)爭(zhēng)力。 5. 研究成果將以論文形式表現(xiàn)，發(fā)表高水平論文 2030篇（ 其中 510篇 0），申請(qǐng) 1015項(xiàng)發(fā)明專利。 三、研究方案 （一）課題總體思路 鑒于目前蛋白質(zhì)組研究比較多 地側(cè)重于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究上，對(duì)于在重要生理、病理過程中調(diào)控通路的蛋白質(zhì)間的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白質(zhì)是在有機(jī)體內(nèi)發(fā)揮生理功能的；而機(jī)體內(nèi)存在著眾多可與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子物質(zhì)，其中包括代謝產(chǎn)物。內(nèi)源性代謝產(chǎn)物可能和蛋白質(zhì)結(jié)合，從而改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象和功能。因此，研究?jī)?nèi)源性代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)組的作用是進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)在活體的功能是至關(guān)重要的，尤其是如能發(fā)現(xiàn)可直接與代謝產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，不但對(duì)于了解重要的生理、病理調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，而且也將有助于蛋白質(zhì)學(xué)的研究更加深入，更有望 了解各重要生理、病理過程的機(jī)制；有望形成蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)分支，即小分子活性物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控。 體來講國內(nèi)外對(duì)該領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。通過本課題的研究，有望分析 蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本規(guī)律，揭示 控若干重要心血管生理、病理過程的機(jī)制。其研究成果還有望對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展作出一定的貢獻(xiàn)。 （二）課題的特色和創(chuàng)新點(diǎn) 心臟離子通道功能調(diào)節(jié)和血管新生是調(diào)節(jié)心臟生理功能和心臟缺血等疾病的重要調(diào)控通路 ，本課題組于 2007 年和 2008 年分別發(fā)現(xiàn)了 上述兩條心血管通路的調(diào)節(jié)作用。本課題組發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中， 制心肌細(xì)胞膜 L 型 道的開放；在內(nèi)皮細(xì)胞中，移、管腔形成以及在整體模型中的血管新生。但是 其是 項(xiàng)目在前期工作的基礎(chǔ)上，推定 子通道，或與其相偶連的信號(hào)分子；在內(nèi)皮細(xì)胞直接作用于 1 生存素信號(hào)通路中 的信號(hào)分子，在此有限范圍中尋找 接作用的靶分子。 如能取得成功，對(duì)于揭示蛋白）的空間構(gòu)象和功能的具有重要的科學(xué)意義，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一種蛋白功能調(diào)控的新規(guī)律。 首次應(yīng)用代謝組學(xué)方法系統(tǒng)研究含硫氨基酸及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、在體內(nèi)的代謝途徑，包括 有關(guān)中間代謝產(chǎn)物 。此外，針對(duì)缺血、缺氧性心臟疾病，特別是含硫氨基酸及 探針?biāo)幬?行生物化學(xué)，結(jié)構(gòu)研究和代謝功能的研究，及上述代謝途徑的變化 。在此基礎(chǔ)上，篩選和優(yōu)化具有治療前景的可以生 成內(nèi)源性 化合物，并進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)改造。項(xiàng)目涉及的領(lǐng)域和技術(shù)非常多，預(yù)期在缺血、缺氧性心臟疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療和醫(yī)藥開發(fā)方面取得突破性進(jìn)展。 首次通過裂殖酵母模式生物的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)重點(diǎn)研究 細(xì)胞周期， 細(xì)胞增殖和凋亡過程中 信號(hào)通路的影響，結(jié)合用釀酒酵母的突變體庫的篩選 分離出 胞效應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的多個(gè)重要蛋白因子，找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌細(xì)胞中的同源蛋白，進(jìn)一步利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)，生物化學(xué)的方法研究蛋白之間，蛋白和 合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué) , 生物化學(xué) 和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的結(jié)果，揭示 闡明 通過轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)構(gòu)建攜帶 基因小鼠，從而在整體水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟中內(nèi)源性 明生理和病理?xiàng)l件下心臟內(nèi)源性 控機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過藥物干預(yù)心臟內(nèi)源性 明體內(nèi) 而探討 利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，實(shí)現(xiàn) 對(duì) 時(shí)研究心臟內(nèi)源性 闡明各自的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又研究?jī)蓷l途徑之間的關(guān)聯(lián)。既研究生理?xiàng)l件下內(nèi)源性 強(qiáng)調(diào)缺血、缺氧等病理?xiàng)l件下調(diào)控機(jī)制的變化。研究 討內(nèi)源性 （三）課題設(shè)置 課題 1. 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物 心臟細(xì)胞 離子通道和血管新生 通路的調(diào) 控 機(jī)制 主要 研究?jī)?nèi)容 ： 離子通道和血管新生 是與心臟 生理、病理 疾病密切相關(guān)的兩條重要 調(diào)節(jié)通路 。 本課題組首先發(fā)現(xiàn) 影響 上述兩條重要調(diào) 控 通 路 ，并在 前期研究 中率先 發(fā)現(xiàn) 抑制心肌細(xì)胞膜 上 L 型 道的開放； 可 促進(jìn) 內(nèi)皮 細(xì)胞增殖、遷移、 形成新的 血管 。在 此 基礎(chǔ) 上 ，我們擬深入 研究 控 L 型 道 與促血管新生 的分子機(jī)制 ，確定 用的關(guān)鍵靶蛋白，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過 徑干預(yù)心臟病打下基礎(chǔ) 。 研究目標(biāo)： 1. 揭示若干 控跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通路，找到若干 接作用的靶分子，深入研究 其的調(diào)控機(jī)制。 2. 找到 控血管新生的直接作用靶點(diǎn)，深入研究 調(diào)控血管新生機(jī)制。 3. 發(fā)現(xiàn) 不同靶分子蛋白上共同的可結(jié)合的位點(diǎn)或 共有的化學(xué)修飾方式。 課題 承擔(dān)單位：復(fù)旦大學(xué)；上海理工大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：朱依純 教授 課題參加人員 ：王睿 、 錢睿哲 、 付偉 、 盧寧 、 蔡文杰 、 王文偉 經(jīng)費(fèi)比例： 23 課題 2. 真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)譜、 蛋白間相互作用 以及蛋白與核酸的相互作用的調(diào)控 主要 研究?jī)?nèi)容 ： 最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞具有獨(dú)特的調(diào)控作用。 本課題 以 酵母 為 模式生物 ，通過 基因組學(xué)和蛋白組學(xué) 的方法，闡明 響 細(xì)胞周期 、 細(xì)胞增殖和 細(xì)胞 凋亡 的信號(hào)通路， 確定 用的重要靶分子，繪制 一幅完整的 胞效應(yīng) 的 信號(hào)通路圖 。將酵母中的 研究結(jié)果進(jìn)一步到 心肌細(xì)胞 加以驗(yàn)證。該工作有望全面系統(tǒng)的闡明 胞效應(yīng)的分子機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 為通過 徑干預(yù)重大疾病找到新的靶點(diǎn) 。 研究目標(biāo) ： 結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué) , 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的結(jié)果在裂殖酵母中繪制一幅完整的 胞效應(yīng)得 信號(hào)傳導(dǎo)通路圖 。 分離出多個(gè)參與 細(xì)胞周期， 細(xì)胞增殖和凋亡過程中 信號(hào)通路中的重要蛋白因子，重點(diǎn)研究重要蛋白因子在各個(gè)信號(hào)通路中的作用機(jī)理，揭示 胞效應(yīng)的分子機(jī)制 ， 為在哺乳動(dòng)物中 揭示 胞效應(yīng)的分子機(jī)制和闡明 生理病理上的作用提供巨大的幫助和 奠定基礎(chǔ)。 課題 承擔(dān)單位： 復(fù)旦大學(xué)；南開大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 授 課題 參加人員 ： 陳東戎 、 王哲 、 王銘潔 、 霍克克 經(jīng)費(fèi)比例： 20 課題 3. 含硫氨基酸及其衍生物 對(duì)心臟作用靶點(diǎn)及 代謝途徑研究 主要研究?jī)?nèi)容： 體內(nèi) 含硫氨基酸及從食物中攝入的含硫化合物通過酶的作用分解代謝產(chǎn)生 臟中產(chǎn)生 關(guān)鍵酶是 本課題 首次發(fā)現(xiàn)半胱氨酸衍生物 過促進(jìn) 成而 具有心血管保護(hù)作用。我們 進(jìn)一步合成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的 半胱氨酸衍生物 具有更好的心血管保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，我們擬通過代謝組學(xué)的方法， 全面揭示含硫氨基酸 及其衍生物（如 體內(nèi)的代謝規(guī)律 ，確定 與含硫氨基酸及探針?biāo)幬?臟 保 護(hù)作用密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì) ，并對(duì)其功能進(jìn)行 深入 研究 。設(shè)計(jì)、優(yōu)化、合成更好的具有藥用前景的 體化合物，為 體藥物的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ) 。 研究目標(biāo)： 1. 闡明 心 肌缺血 保護(hù)作用 的分子機(jī)制，鑒定出其作用的關(guān)鍵蛋白，揭示其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 2. 進(jìn)一步優(yōu)化 結(jié)構(gòu) ， 設(shè)計(jì)合成出具有更好心肌保護(hù)作用的 體化合物，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 3. 闡 明含硫氨基酸和 體內(nèi)的代謝途徑，確定其代謝的關(guān)鍵酶，建立體內(nèi)含硫氨基酸代謝途徑研究的關(guān)鍵技術(shù)。 4. 闡明缺血、缺氧病理?xiàng)l件下 心肌保護(hù)作用的機(jī)制和經(jīng)由 代謝途徑，鑒定出其影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和信號(hào)通路，揭示 否具有反饋調(diào)節(jié)作用 ，從而發(fā)現(xiàn)干預(yù)心臟疾病病的全新靶蛋白。 課題 承擔(dān)單位： 復(fù)旦大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 朱依諄 教授 學(xué)術(shù)骨干： 郭薇 、林國強(qiáng)、 儲(chǔ)以微 、 趙偉利 、 孫遜 、 魏邦國 、 古險(xiǎn)峰 經(jīng)費(fèi)比例： 34 課題 4. 心 肌 中 局部 內(nèi)源性 成調(diào)控及傳遞 主要 研究?jī)?nèi)容 ： 以小鼠為模式動(dòng)物，綜合 運(yùn)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，著重研究已知的心臟中內(nèi)源性 生成關(guān)鍵 酶 心臟生理和病理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控，闡明其信號(hào)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本課題同時(shí)研究 徑在心臟內(nèi)源性 生中的作用及在心臟生理和病理過程中的表達(dá)調(diào)控。本課題還將研究?jī)?nèi)源性 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的傳遞及傳遞過程中與氧化性小分子及金屬離子的相互作用，探討其在體內(nèi)的代謝途徑。 研究 目標(biāo) ： 1. 構(gòu)建攜帶 動(dòng)子控制的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在整體水平上實(shí)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下和病理?xiàng)l件下對(duì) 達(dá)調(diào)控的實(shí)時(shí)觀測(cè)和在體研究。 2. 通過生物信息學(xué)、分 子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物物理的方法闡明生理?xiàng)l件和病理?xiàng)l件下達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，闡明調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。 3. 闡明 徑在心臟生病理?xiàng)l件下表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，及其對(duì)心臟內(nèi)源性 生的作用。 4. 闡明 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的傳遞過程，以及傳遞過程中與氧化性小分子和金屬離子的反應(yīng)特性。 課題 承擔(dān)單位：同濟(jì)大學(xué) ；復(fù)旦大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人：郭占云 研究員 學(xué)術(shù)骨干： 查錫良 、 郜洪文 、 楊奕清 、 孫曉宇 、 邵曉霞 、 朱融融 、 吳玲玲 博士后 經(jīng)費(fèi)比例： 23% （四）課題技術(shù)路線 （五）各課題關(guān)系： 本項(xiàng)目為確保參加單位 分工協(xié)作、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，在明確合作方式的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)與課題組核心單位以外的其它在學(xué)科、資源、技術(shù)及人才方面有優(yōu)勢(shì)的實(shí)驗(yàn)室協(xié)作，并吸收優(yōu)秀人才以個(gè)人所在實(shí)驗(yàn)室身份加入到對(duì)口的課題承擔(dān)單位負(fù)責(zé)或參加本課題研究，以保證科研隊(duì)伍組成的最佳化。實(shí)現(xiàn)技術(shù)平臺(tái)共用、科研資源共享，研究目標(biāo)集中、點(diǎn)面結(jié)合及研究?jī)?nèi)容緊密銜接等組織形式。同時(shí)，課題實(shí)行 2 3的滾動(dòng)制，制訂課題完成質(zhì)量的定量考核標(biāo)準(zhǔn)，半年和一年分別進(jìn)行一次研究進(jìn)度考核。完成不好的課題將減少科研經(jīng)費(fèi)，完成好的課題將增加科研經(jīng)費(fèi)。 2年完成不好的單位和個(gè)人承擔(dān)的課題將被取消 ，重新吸收新的課題組進(jìn)行本課題的研究或?qū)⒔?jīng)費(fèi)集中到其它有望獲得較大突破的課題。 為保證項(xiàng)目的順利完成及與其它 “973”項(xiàng)目的無縫銜接，項(xiàng)目將聘請(qǐng)國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的著名專家，特別是 “973”相關(guān)領(lǐng)域的首席科學(xué)家，擔(dān)任本項(xiàng)目的學(xué)術(shù)顧問并成立相應(yīng)的顧問委員會(huì)，監(jiān)督本項(xiàng)目的實(shí)施，參與本項(xiàng)目的管理并提出合理化建議。 本項(xiàng)目第一子課題的研究方案針對(duì) 心肌細(xì)胞離子通道的調(diào)控和 血管新生作用的兩條重要生理、病理通路，結(jié)合內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控形成，盡管上述研究可使我們?cè)诿鞔_的生理、病理通路中研究 蛋白質(zhì)靶分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，但其局限性也是勿庸置疑的。 由此再間接地影響上述通路。因此，還必須同時(shí)在更廣的范圍內(nèi)尋找 靶蛋白，以便發(fā)現(xiàn) 靶蛋白結(jié)合的共同規(guī)律；還要應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，觀察 否還能通過調(diào)控基因表達(dá)而使細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生變化，并分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與核酸間的相互作用。這部分研究將構(gòu)成第二子課題的主要研究方案。第二子課題研究中所得到的較全面的關(guān)于 節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究結(jié)果，將為第一子課題的研究提供更全面的信息。另一方面，第一子課題中關(guān)于 于特定蛋白靶分子及其相互作用的研究結(jié)果，將有助于分析第二子課題中觀察到的蛋白質(zhì)和基因表達(dá)譜的諸多變化，有助于分析上述變化中基因表達(dá)產(chǎn)物之間的相互關(guān)系，繼而可據(jù)此通過基因敲除等方法確認(rèn)上述因果關(guān)系。因此，通過第一和第二子課題在研究過程中的互動(dòng)，綜合應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和生理、病理學(xué)研究方法，既在由本課題組首先發(fā)現(xiàn)的兩條重要心血管調(diào)控通路中有的放矢地研究 靶蛋白分子空間結(jié)構(gòu)和動(dòng)能 的調(diào)控及其生理、病理學(xué)意義，又能全面地反映 過學(xué)科交叉的互補(bǔ)作用，使 入的解答。 鑒于 一種具有心血管調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)代謝過程值得研究。由體內(nèi)含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）作為底物代謝產(chǎn)生的。但是，上述 2S 生成的作用及其機(jī)制仍有待闡明，尤其是其組織特異性的作用，如在心臟中對(duì)局部 成的調(diào)節(jié)作用至今不明。因此本項(xiàng)目第三子課題擬應(yīng)用代謝組學(xué)方法研究含硫氨基酸及其衍生物的體 內(nèi)代謝過程，研究其對(duì)內(nèi)源性 生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。此外，還將以本課題組特有的含硫氨基酸衍生物 過研究其為何具有獨(dú)特的調(diào)節(jié) 析含硫氨基酸在體內(nèi)的代謝過程。 此外，由于 體內(nèi)的半衰期極短；而其最重要的調(diào)節(jié)作用又發(fā)生在心血管系統(tǒng)，對(duì)于 心臟效應(yīng)來說，局部生成的 能發(fā)揮更重要的調(diào)節(jié)作用。因此，本項(xiàng)目中還將設(shè)置子課題四，重點(diǎn)研究心肌局部 課題四同時(shí)研究心肌缺血、缺氧等病理狀態(tài)下心肌局部 能發(fā)現(xiàn)新的生成 謝途徑。 因此，子課題三是在整體水平上地應(yīng)用代謝組學(xué)的方法系統(tǒng)地研究含硫氨基酸及其衍生物的代謝途徑，除了 生成外，還觀察所有相關(guān)中間產(chǎn)物的生成，可望對(duì)內(nèi)源性 子課題四則在此基礎(chǔ)上重點(diǎn)研究心肌局部的 關(guān)于內(nèi)源性 謝的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步得到深入。事實(shí)上，子課題三、四中調(diào)控 成的關(guān)鍵因子 此，子課題三、四的研究也可認(rèn)為是關(guān)于蛋白質(zhì)對(duì) 用的研究。而子課題一、二則屬于 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用。 通過上述四個(gè)子課題的研究，可分析 蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本規(guī)律，揭示 控若干重要心血管生理、病理過程的機(jī)制。其研究成果還有望對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展作出一定的貢獻(xiàn)。 四、年度計(jì)劃 2010 年 1 月至 2010 年 12 月 1. 研究?jī)?nèi)容 1）在心肌細(xì)胞中研究 介導(dǎo) 型 道抑制效應(yīng)中的作用；闡明 2S/ 2） 研究在血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否存在 1 生存素通路，并研究這一通路分別與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及管腔形成的關(guān)系。 3）用裂殖酵母生物芯片對(duì)比在細(xì)胞內(nèi) 有 2 4）在釀酒酵母中全基因組基因敲除的文庫和全基因組基因基因過表達(dá)的文庫，對(duì)比在細(xì)胞內(nèi) 有 2 5）闡明 其衍生物對(duì) 否具有反饋調(diào)節(jié)作用； 氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞的比較蛋白組學(xué)研究。 6）明確 腎臟及肝臟中的代謝，完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。 7） 克隆 調(diào)控區(qū)，構(gòu)建用于轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)載體；通過顯微注射的方法構(gòu)建攜帶 培養(yǎng)心肌細(xì)胞 ， 通過 建立測(cè)定體內(nèi) 化性小分子和金屬離子的方法。 2. 預(yù)期目標(biāo) 1）闡明 2S/ 2）闡明 1 生存素通路對(duì)血管新生的影響。 3）利用在釀酒酵母中所得結(jié)果對(duì)比，補(bǔ)充和證實(shí)裂殖酵母在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，闡明在細(xì)胞內(nèi)有 2 4）構(gòu)建出 動(dòng)子 步得到攜帶 動(dòng)子控制的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；建立小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)體系，確定 立起測(cè)定體內(nèi) 化性小分子和金屬離子的方法。 5） 闡明 心肌缺血時(shí)線粒體 子通道的影響及其抗氧化作用關(guān)鍵蛋白 6）揭示 放 出其代謝過程中的關(guān)鍵酶。7）發(fā)表 篇以上，申請(qǐng)專利 1 2項(xiàng)。 8）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25名以上。 2011 年 1 月至 2011 年 12 月 1. 研究?jī)?nèi)容 1）研究 的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合后靶分子空間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。 2）研究 3) 利用雙向電泳和質(zhì)譜的方法，對(duì)比在細(xì)胞內(nèi)有硫化氫和沒有硫化氫的條件下全基因組蛋白表達(dá)譜的差異。 4）通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì) 相互作用進(jìn)行了初步研究。分析 性位點(diǎn)的化學(xué)性質(zhì)，在設(shè)計(jì)中引入羥基，肼基，羧基，胍基，脲基，羥胺基等極性基團(tuán)以加強(qiáng)與 行活性篩選。 5）通過生物信息學(xué)、 選轉(zhuǎn)基因小鼠并建系；研究抑制 達(dá)后 徑的變化；研究 細(xì)胞膜的相互作用。 2. 預(yù)期目標(biāo) 1）闡明 的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合后靶分子空間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。 2）闡明 3）得到生物芯片和蛋白差異表達(dá)譜，分離出重要蛋白因子 。 4) 完成在巰基上引入一系列疏水片段，以加強(qiáng) 將該一系列化合物應(yīng)在心肌 缺血模型上驗(yàn)證心肌的保護(hù)作用，完成 合物 的初篩。 5） 找到調(diào)控 立轉(zhuǎn)基因小鼠純系；在 白質(zhì)和酶活力水平確定 抑制后 徑的變化；建立研究 膜作用的研究方法，闡明作用的特性。 6）發(fā)表 篇以上，申請(qǐng)專利 1 2項(xiàng)。 7）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25名以上。 2012年 1月至 2012年 12月 1. 研究?jī)?nèi)容 1） 1而抑制其開放。在心肌細(xì)胞 中觀察同位素標(biāo)記的 型 道結(jié)合（包括 1）。 2）觀察 2S/ 3） 找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌細(xì)胞中的同源蛋白。用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時(shí)利用 術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 免疫共沉淀（ 和 凝膠阻滯（ 離子表面共振的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象； 4） 將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細(xì)胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化氫在細(xì)胞中的濃度對(duì)比野生型細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和敲除細(xì)胞的表型。 5） 采用基因突變技術(shù)改變 蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析 靶蛋白上的作用位點(diǎn)，揭示 理過程的影響。 6） 通過活體成像技術(shù)，監(jiān)測(cè)報(bào)告基因在生理?xiàng)l件下表達(dá)調(diào)控；研究 7） 利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立 I/擬病理?xiàng)l件下抑制 后 究外源 2. 預(yù)期目標(biāo) 1）闡明 介導(dǎo)的 定作用而間接調(diào)控 1而抑制其開放。 2）闡明 型 道結(jié)合。 3）闡明 4） 揭示硫化氫對(duì)蛋白， 5） 觀察 變 析 示 理過程的影響。 7） 實(shí)驗(yàn) 明 建立起小鼠 I/ 8） 在 白質(zhì)和酶活力水平確定病理?xiàng)l件下 闡明外源 9）發(fā)表 篇以上 ， 申請(qǐng)專利 1 2項(xiàng) 。 10）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 20名以上。 2013 年 1 月至 2013 年 12 月 1. 研究?jī)?nèi)容 1）在心肌細(xì)胞中觀察 L 型 道的 1亞單位的相 應(yīng)位點(diǎn)是否被激活。在 型 道的 1亞單位，研究 型 道的機(jī)制。 2）通過核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜掃描、元素分析等實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，研究 3） 將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母 /大鼠心肌細(xì)胞中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細(xì)胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低 硫化氫在細(xì)胞中的濃度對(duì)比野生型細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和敲除細(xì)胞的表型 。 4） 用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋 白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時(shí)利用 免疫共沉淀（ 凝膠阻滯（ 等離子表面共振 ） 生物 對(duì)缺血、缺氧狀態(tài)