DB21T 1687-2008 生鮮肉中三聚氰胺的測定

46 備案號： 遼 寧 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn) 1687 2008 生鮮肉中三聚氰胺的測定 008布 2008施 遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布 1687 2008 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理局提出并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄 本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量及畜產(chǎn)品安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（沈陽）。 本標(biāo)準(zhǔn)起草人：王淑芬 張建勛 劉全 劉敬先 劉凱 楊希國 于家豐 王麗娜 田曉玲 曲韻坤。 本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。 1687 2008 1 生鮮肉中三聚氰胺的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生鮮肉中三聚氰胺殘留檢測的制樣和酶聯(lián)免疫（ 、高效液相色譜（ 、氣相色譜 定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于 生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中三聚氰胺殘留檢測。 本標(biāo)準(zhǔn)中的酶聯(lián)免疫法為篩選方法，篩選結(jié)果為陽性的樣品需要用仲裁法確證，高效液相色譜法和氣相色譜 中氣相色譜 聯(lián)免疫法定量限為 效液相色譜法定量限為 相色譜 2 規(guī)范性引用文件 下列文件的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否 可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法 3 制樣 樣的制備 從原始樣品中分取出約 500g，經(jīng) 絞肉機(jī)絞碎、勻質(zhì)使均勻。 樣的保存 下貯存。 4 酶聯(lián)免疫法 理 本方法基于酶聯(lián)免疫法中的競爭性測定法原理，通過樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，除去未結(jié)合的三聚氰胺酶標(biāo)記物后，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)，加終止液后在 450光度值與樣品中的三聚氰 胺含量成反比。 劑和溶液 特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。水應(yīng)符合 6682二級水的規(guī)定。 聚氰胺試劑盒（附系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，酶標(biāo)記物，清洗液、底物，終止液，說明書）。 辛烷（ 氯甲烷（ 辛烷 +三氯甲烷混合液：準(zhǔn)確量取 40 60混勻即得。 0%甲醇 /20取 12定容至 1000此溶液 900加入 100 器和設(shè)備 標(biāo)儀（帶 450光片）。 旋混合器。 1687 2008 2 凍離心機(jī)。 量加樣器： 20L、 50L、 100L、 150L、 250L。 溫干燥箱。 析天平：感量 蕩器 肉機(jī) 漿機(jī) 定步驟 品處理 準(zhǔn)確稱量 2確到 入 100%甲醇 /20渦旋 30s，振蕩 5000r/ 2三氯甲烷混合液（ 混勻， 4000r/置，取上層 150 試程序 取出欲測數(shù)量的微孔條安插在酶標(biāo)板上，分別吸取 0g/L、 20g/L、 100g/L、 250g/L、 500g/試樣萃取液（ 150別加入 50蕩使混勻， 25左右孵育 30盡酶標(biāo)板，清洗液（ 板 4次，拍干。加 100每個(gè)微孔中，振蕩使混勻， 25左右孵育 30 100每個(gè)微孔中，振蕩混 勻， 450 注：不同品牌的試劑盒其操作步驟可能略有差異，比如稀釋倍數(shù)，具體操作步驟可根據(jù)試劑盒使用說明書略作調(diào)整。 試劑盒使用前恢復(fù)到室溫。 標(biāo)準(zhǔn)和樣品做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確性。 果計(jì)算 以空白溶液（濃度為 0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值為 100%作為計(jì)算基準(zhǔn)，折算出各標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣萃取液的相對吸光度值。 相對吸光度值（ %） = 繪制標(biāo)準(zhǔn)相對吸光度值與濃度（ g/L） 關(guān)系曲線，校正曲線在 20g/范圍內(nèi)為線性。試樣萃取液的濃度（ g/L） 可以從校正曲線上讀出。 5 高效液相色譜法 理 試料中的三聚氰胺經(jīng)三氯乙酸和乙酸鉛提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性雜質(zhì)，混合型陽離子交換固相萃取小柱凈化，高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。 劑和材料 除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。除色譜用水應(yīng)符合 6682一級水的規(guī)定外，水應(yīng)符合 6682二級水的規(guī)定。 聚氰胺對照品：含三聚氰胺（ 不得少于 氯甲烷（ 。 腈 (色譜純。 醇（ :色譜純。 烷磺酸鈉（ 檬酸（ 2O）。 100空白吸光度值 萃取液吸光度值）標(biāo)準(zhǔn)吸光度值（或試樣 （ 1） 1687 2008 3 水（ 2O）。 氣 (普通氮?dú)狻?三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸 20g 于 1000量瓶中，用水溶解后定容至刻度。 乙酸鉛溶液：準(zhǔn)確稱取乙酸鉛 22000水溶解后定容至刻度。 0%甲醇溶液：準(zhǔn)確量取 20 100水定容至刻度。 %氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取 5 100甲醇（ 容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)制。 子對緩 沖溶液：稱取 1000水稀釋至刻度，搖勻。 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精確稱取約 50精確到 50 20%甲醇溶液（ 解并定容至刻度，配制成濃度為 1mg/標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于 4避光保存。 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：用移液管準(zhǔn)確吸取 準(zhǔn)貯備液（ 50 20%甲醇溶液（ 容至刻度，配成濃度為 100 g/ 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取 100 20%甲醇溶液（ 容至刻度，配制濃度為 g/ 器和設(shè)備 效液相色譜儀（配紫外檢測器）。 譜柱： 析天平：感量 平：感量 織勻漿機(jī)。 漿杯： 30 心機(jī) 心管： 50 合型陽離子 交換固相萃取柱： 60 相萃取裝置。 氣吹干儀。 旋混合器。 蕩器。 孔濾膜： m。 定 取 ?。?2 置 50次加入 10 2 3渦旋 30速振蕩提取 1010000r/上清液備用。 化 依次用 3 3取備用上清液（ 部過柱，再依次用 33洗，抽干。用 5脫，收集洗脫液置試管中。于 60下用氮?dú)獯蹈桑尤?試管中，渦旋 10s，用微孔濾膜（ 濾，濾液供高效液相色譜儀分析。 定 1687 2008 4 譜條件 色譜柱： 度 5 m， 25 流動(dòng)相： 900 100搖勻。 檢測波長： 240 柱溫： 30。 流速： 進(jìn)樣體積： 20 L。 定 取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。 白試驗(yàn) 除不加試料外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。 果計(jì)算與表述 試料中三聚氰胺的殘留量按式（ 2）計(jì)算： X=1000000s （ 2） 式中： X 試料中三聚氰胺的含量 ,單位為毫克每千克（ mg/ C 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（ g/ A 試樣溶液中三聚氰胺的峰面積； 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積； M 供試試樣質(zhì)量，單位為克（ g）。 V 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（ 注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。 法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 敏度 三聚氰胺在豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的定量限為 確度 本方法在 0% 110%。 密度 本方法的批內(nèi)變異系數(shù) 15%，批間變異系數(shù) 20%。 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖、豬肉樣品空白色譜圖、豬肉樣品回收色譜圖見附錄 6 氣相色譜 理 試料中殘留的三聚氰胺經(jīng)三氯乙酸和乙酸鉛提取并沉淀蛋白、三氯甲烷去除脂溶性雜質(zhì)，經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取小柱凈化，雙三甲基三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷衍生，氣相色譜 m/ 劑和材料 除特殊注明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑 均為分析純。水應(yīng)符合 6682二級水的規(guī)定。 聚氰胺對照品：含三聚氰胺（ 不得少于 氯甲烷（ 。 腈 (色譜純。 醇（ :色譜純。 1687 2008 5 烷磺酸鈉（ 檬酸（ 2O）。 水（ 2O）。 氣 (普通氮?dú)狻?啶 (優(yōu)級純。 三甲基硅基三氟乙酰胺（ +三甲基氯硅烷 (99:1。 三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸 20000用水溶解后定容至刻度。 乙酸鉛溶液：準(zhǔn)確稱取乙酸鉛 22000水溶解后定容至刻度。 0%甲醇溶液：準(zhǔn)確量取 20 100水定容至刻度。 %氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確量取 5 100甲醇（ 容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)制。 取 1000水稀釋至刻度，搖勻。 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精確稱取約 50精確到 用 20%甲醇溶液（ 解并定容至刻度，配制成濃度為 1mg/ 4避光保存。 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取 50 20%甲醇溶液（ 釋、定容，配成濃度為 100 g/標(biāo)準(zhǔn)中間液。 聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取 100用甲醇 （ 釋、定容至濃度為 g/ 器和設(shè)備 相色譜 細(xì)管柱： 細(xì)管柱 。 析天平：感量 平：感量 織勻漿機(jī)。 漿杯： 30 心機(jī)。 心管： 50 合型陽離子交換固相萃取柱： 60 相萃取裝置。 氣吹干儀。 旋混合器。 蕩器。 孔濾膜：孔徑 m，有機(jī)相。 定 取 ?。?2 置 50次加入 10 2 3渦旋 30速振蕩提取 1010000r/上清液備用。 化 依次用 3 3取備用上清液（ 部過柱，再依次用 33洗，抽干。用 5脫。 生化 1687 2008 6 將洗脫液（或根據(jù)洗脫液中三聚氰胺的濃度用甲醇適當(dāng)稀釋）在 60下用氮?dú)獯蹈?，加?300 00 渦旋混勻，密封玻璃塞， 70在恒溫干燥箱中反應(yīng) 30卻后用微孔濾膜（ 濾，濾 液用氣相色譜 準(zhǔn)曲線的制備 分別準(zhǔn)確吸取 g/ 因試樣溶液最終定容體積為 對應(yīng)濃度對應(yīng)分別是 g/g/g/g/g/相色譜 一個(gè)濃度重復(fù)測定 2次，測得的峰面積平均值與對應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 定 相色譜 色譜柱： 或相當(dāng)者 。 載氣：氦氣，流速為 進(jìn)樣量： 1 L。 進(jìn)樣口溫度： 260。 升溫程序：起始溫度 75，持續(xù) 30 /00，保持 傳輸線溫度： 280。 運(yùn)行時(shí)間： 掃描范圍： 60m/z。 掃描模式： 選擇離子監(jiān)測（ 。監(jiān)測離子 m/171、 327、 342，定量離子 m/ 離子源： 離子源溫度： 230。 70 定 定性方法：衍生后試樣溶液峰與三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品峰保留時(shí)間的 相對偏差不大于 且四個(gè)監(jiān)測離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液的四個(gè)監(jiān)測離子豐度比一致（即相差在 20%以內(nèi)），可判斷試樣中含有三聚氰胺。 定量方法：取 衍生后的標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣溶液，以 m/峰）面積積分值 進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn) 。 白試驗(yàn) 除不加試料外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。 果計(jì)算與表述 試料中三聚氰胺的殘留量按式（ 3）計(jì)算： X=1000000s （ 3） 式中： X 試料中三聚氰胺的殘留量 ,單位為毫克每千克（ mg/ C 標(biāo)準(zhǔn)工作液中三聚氰胺的上機(jī)濃度，單位為微克每毫升（ g/ A 試樣溶液中經(jīng)衍生化三聚氰胺 327碎片離子的峰面積； 標(biāo)準(zhǔn)工作液中經(jīng)衍生化三聚氰胺 327碎片離子的峰面積； M 供試試樣質(zhì)量，單位為克（ g）； V 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（ P 稀釋倍數(shù)。 注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均 值表示，保留三位有效數(shù)字。 法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度 敏度 1687 2008 7 三聚氰