植物細(xì)胞的選育與改良.ppt

1、第三章植物細(xì)胞的選育與改良,南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 羅麗萍副教授,植物細(xì)胞的篩選,植物細(xì)胞的誘變,植物原生質(zhì)體融合,植物細(xì)胞的基因重組與轉(zhuǎn)移,離體培養(yǎng)下的遺傳與變異特點(diǎn),Larkin and Scowcroft(1981)提出把由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱(chēng)為體細(xì)胞無(wú)性系（somaclones），而把這些植株所表現(xiàn)出來(lái)的變異稱(chēng)之為體細(xì)胞無(wú)性系變異（somaclonal variation）,從對(duì)生物遺傳的影響而言，細(xì)胞工程技術(shù)本身即包含了雙重性：遺傳穩(wěn)定性和變異性。 對(duì)于單純的繁殖技術(shù)而言，離體培養(yǎng)的技術(shù)操作是細(xì)胞或組織或個(gè)體的不斷復(fù)制，因而一般來(lái)講其繁殖群體具有較好的遺傳穩(wěn)定性。 細(xì)胞工

2、程還有一類(lèi)技術(shù)操作，其目的就在于創(chuàng)造變異，如體細(xì)胞人工突變、基因轉(zhuǎn)移、體細(xì)胞融合等。這些離體操作技術(shù)，在某種程度上說(shuō)具有一定的目的性和方向性，可在短期內(nèi)獲得從自然界可能要經(jīng)過(guò)幾年乃至上百年的進(jìn)化才能獲得的性狀，從而加速生物進(jìn)化的進(jìn)程。,第一節(jié)離體培養(yǎng)下的遺傳與變異特點(diǎn),離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性,影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素,離體培養(yǎng)下的變異,一、離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性,離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂。有絲分裂的DNA半保留復(fù)制和染色體均等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。,在準(zhǔn)確選擇培養(yǎng)方式的前提下，離體無(wú)性繁殖可以具有較高的遺傳穩(wěn)定性（Phillip等，1994）。正

3、是基于這一理論，利用離體培養(yǎng)技術(shù)建立了多種植物的無(wú)性繁殖體系。 離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個(gè)方面是，即使發(fā)生某些變異，也可以即時(shí)淘汰變異。,二、離體培養(yǎng)下變異特點(diǎn),變異的普遍性,嵌合性,變異的局限性,變異的普遍性,變異發(fā)生在 各種培養(yǎng)類(lèi)型中,不同培養(yǎng)類(lèi)型 變異頻率不同,與有性重組相比，體細(xì)胞突變性狀具有一定局限性 從表型上看，在不同植物類(lèi)型中經(jīng)常發(fā)生的變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長(zhǎng)勢(shì)、育性、某些抗性等性狀的變異。 從生理生化特性上看容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長(zhǎng)等變異。,嵌合性： 體細(xì)胞變異常以嵌合體的形式存在。 嵌合體可能不同倍性的形式也有其它類(lèi)型。 嵌合體必須通過(guò)分離

4、培養(yǎng)才能純化。,三、影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素,供體植物 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式 繼代培養(yǎng)的次數(shù),供體植物遺傳背景,倍性水平：處于二倍體水平上的細(xì)胞比處于單倍體水平上的細(xì)胞較為穩(wěn)定。 基因型：植物種內(nèi)基因型間變異頻率差異較大。,供體植物,供體植物生理狀態(tài),以分生組織為外植體的再生植株通?？梢跃S持供體植物的典型性，體細(xì)胞變異頻率很低。 以分化組織為外植體的再生植株容易發(fā)生體細(xì)胞變異，其頻率與分化程度有關(guān)。,供體植物,培養(yǎng)基激素,培養(yǎng)基激素濃度和不同激素配比對(duì)再生植株的染色體倍性有一定影響。 激素引起的變異大多為倍性增加。 少數(shù)情況下，激素引起類(lèi)減數(shù)分裂而使倍性減少。,培養(yǎng)基及 培養(yǎng)方式,培養(yǎng)基物理狀態(tài)

5、,一般來(lái)講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。,培養(yǎng)基及 培養(yǎng)方式,培養(yǎng)類(lèi)型,原生質(zhì)體培養(yǎng)的體細(xì)胞變異大于細(xì)胞培養(yǎng)，而細(xì)胞培養(yǎng)的變異又大于組織器官培養(yǎng)的變異。在細(xì)胞培養(yǎng)中，性細(xì)胞培養(yǎng)再生植株的變異要大于體細(xì)胞培養(yǎng)的植株。 在因培養(yǎng)類(lèi)型引起的變異中，不僅有染色體倍性的異常變異，同時(shí)基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異、以及非DNA水平引起的變異亦相繼增加。,培養(yǎng)類(lèi)型,繼代次數(shù),由繼代次數(shù)引起的體細(xì)胞變異幾乎在各種類(lèi)型的植物中均有報(bào)道。一般來(lái)講，繼代時(shí)間越長(zhǎng)，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異的機(jī)率就越高。 煙草繼代培養(yǎng)5年的愈傷，其再生植株與供體基因型相比，幾乎沒(méi)有形態(tài)正常的植株，染色體分析顯示，這些植株大多

6、為非整倍體和多倍體。 玉米從剛誘導(dǎo)愈傷組織中分化植株，在形態(tài)上與供體基因型基本一致，但培養(yǎng)3年后愈傷組織的再生能力顯著下降，再生植株生長(zhǎng)異常，細(xì)胞學(xué)分析顯示出染色體斷裂和帶型變異。,繼代培養(yǎng) 的次數(shù),培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，變異越大,天南星科植物，塊莖,菖蒲屬、海芋屬、魔芋屬、天南星屬,第二節(jié) 植物細(xì)胞的篩選,植物細(xì)胞的突變包括自發(fā)突變和誘發(fā)突變。 植物細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中往往發(fā)生不可期的突變，且突變性狀可以穩(wěn)定遺傳，這種變異被稱(chēng)為體細(xì)胞無(wú)性系變異。如防風(fēng)體細(xì)胞。 植物細(xì)胞培養(yǎng)中，自發(fā)突變頻率約為10-810-5，而誘變處理可將頻率提高到10-3，同時(shí)還能獲得自發(fā)突變中很難產(chǎn)生的新突變。 誘變方法： 物

7、理法，如X射線、射線、紫外線、中子等， 化學(xué)法：如甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基脲等。,一、細(xì)胞篩選的方法,1、小細(xì)胞團(tuán)篩選法 小細(xì)胞團(tuán)篩選法是經(jīng)常采用的常規(guī)篩選法，首先制備得到單細(xì)胞，然后在常規(guī)的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)單細(xì)胞培養(yǎng)，形成細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)觀測(cè)細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)、顏色或者測(cè)定細(xì)胞代謝物的種類(lèi)和含量，從而選出所需的細(xì)胞的選育方法。,例一：在長(zhǎng)春花的愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中，得到不同顏色的組織塊，將它們分開(kāi)繼代培養(yǎng)，3周后測(cè)定不同細(xì)胞株系的長(zhǎng)春質(zhì)堿的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)白色細(xì)胞株系產(chǎn)量最高，以白色株系為原株進(jìn)行紫外誘變，選擇壓為色氨酸乙酯鹽酸鹽，因?yàn)殚L(zhǎng)春質(zhì)堿合成的前體物主要有色氨酸和甲瓦龍酸，色氨酸乙酯鹽酸鹽是色氨酸的結(jié)

8、構(gòu)類(lèi)似物，篩選得到抗色氨酸乙酯鹽酸鹽突變株，其中一株長(zhǎng)春質(zhì)的產(chǎn)量增加2.7倍。,例二：采用小細(xì)胞團(tuán)篩選法，篩選花色苷含量高的玫瑰茄細(xì)胞系，獲得一株高產(chǎn)細(xì)胞，用其進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)，花色苷含量和產(chǎn)量分別比對(duì)照提高了14.5倍和16倍。 例三：將黃連的幼葉切塊誘導(dǎo)出愈傷組織，選擇較松散的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體懸浮培養(yǎng)，獲得游離細(xì)胞和細(xì)胞聚集體。經(jīng)60Co、射線輻射誘變和平板培養(yǎng)，篩選出小檗堿含量相當(dāng)于6年生親本植物根莖含量的有8個(gè)細(xì)胞系，最高的細(xì)胞系含量為6.12%。,花色苷含量高的玫瑰茄細(xì)胞系篩選,(1)愈傷組織的誘導(dǎo) 采用B5培養(yǎng)基，玫瑰茄未成熟的花萼或其他組織、器官為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得愈傷組織。

9、(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)及懸浮培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)采用B5培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加 2，4-D 1.0mg/L。 KT：固體培養(yǎng)時(shí)為0.2 mg/L，懸浮培養(yǎng)時(shí)為0.1 mg/L。 蔗糖：20 g/L。 于25、光照培養(yǎng)，17d繼代一次。懸浮培養(yǎng)采用B5培養(yǎng)液，106 r/min旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)，其他條件同愈傷組織培養(yǎng)。,(3)平板培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的玫瑰茄細(xì)胞過(guò)250m銅網(wǎng)，單細(xì)胞得率為85.37%，23個(gè)細(xì)胞小團(tuán)率為8.95%，48個(gè)細(xì)胞小團(tuán)占5.68%。調(diào)整細(xì)胞密度，取一定量的細(xì)胞懸液與冷卻至35以下的B5固體培養(yǎng)基混勻，鋪于9cm培養(yǎng)皿平板。培養(yǎng)條件同上。植板率(PE%)以培養(yǎng)20 d平板上出

10、現(xiàn)的細(xì)胞團(tuán)數(shù)占植板細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來(lái)計(jì)算。 (4)小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng) 采用B5培養(yǎng)基。于玫瑰茄愈傷組織的高色素區(qū)選擇色深且顏色均一的小細(xì)胞團(tuán)置于9cm平板上，每板放置16小團(tuán)，密封。培養(yǎng)條件同前。20 d后轉(zhuǎn)接于50 mL三角瓶中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。,(5)花色苷含量、產(chǎn)量的測(cè)定：培養(yǎng)細(xì)胞收獲，低于40 干燥至恒重，稱(chēng)重。取濕細(xì)胞1 g，用1% HCl甲醇溶液于4 浸提24 h，然后測(cè)定花色苷含量。將色素含量乘以培養(yǎng)物產(chǎn)量即得花色苷的產(chǎn)量。結(jié)果為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。 (6)根據(jù)花色苷含量和產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果，選擇出高含量和產(chǎn)量的細(xì)胞，繼代培養(yǎng)，獲得高產(chǎn)細(xì)胞系。,選擇,2、選擇壓力篩選法,即通過(guò)添加某些對(duì)不同

11、的細(xì)胞有不同作用效果的物質(zhì)，淘汰部分敏感細(xì)胞，而選擇得到所需細(xì)胞的選育方法。 分為正選擇和負(fù)選擇兩種。 正選擇就是把受選擇的細(xì)胞群體置于一定的選擇壓力之下，部分細(xì)胞在選擇壓力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗選擇壓力的細(xì)胞可以生長(zhǎng)，從而選擇得到所需的細(xì)胞。 正選擇適用于對(duì)抗性突變體的選擇，如耐鹽突變體，抗除草劑突變體等 。,負(fù)選擇法也叫富集選擇法，經(jīng)過(guò)誘變劑處理后的細(xì)胞需要及時(shí)進(jìn)行選擇。在最低培養(yǎng)基上，與未突變的細(xì)胞相比，突變細(xì)胞往往會(huì)被淘汰，選擇的對(duì)象是在一定選擇壓的作用下不能生長(zhǎng)的那些細(xì)胞，而能夠生長(zhǎng)的細(xì)胞受到選擇。 適用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體（通過(guò)互補(bǔ)作用對(duì)于體細(xì)胞雜種的選擇具有重要價(jià)值）的

12、選擇。,例：負(fù)選擇法分離煙草營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體,單倍體細(xì)胞誘變處理基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)96h營(yíng)養(yǎng)缺陷型不能繼續(xù)生長(zhǎng)，野生型生長(zhǎng)旺盛把BudR(5-溴脫氧尿苷)加入培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)36h 所有懸浮細(xì)胞植板于完全培養(yǎng)基上繁殖者即為突變細(xì)胞人工加倍純合二倍體的營(yíng)養(yǎng)缺陷型再生植株。 由于BudR只能與活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞中的DNA結(jié)合，并使與它結(jié)合的DNA獲得光敏特性，因此當(dāng)把培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)到光下時(shí)，BudR的光解就引起了能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的那些野生型細(xì)胞的DNA的嚴(yán)重?fù)p傷。而營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞由于沒(méi)有結(jié)合BudR，因此不是光敏的，故不受損傷。,二、影響細(xì)胞篩選效果的因素,1、親本材料對(duì)篩選效果的影響 選用優(yōu)良的、僅存

13、在個(gè)別缺點(diǎn)需要改進(jìn)的基因型。 盡量利用染色體數(shù)目穩(wěn)定的細(xì)胞系，避免采用非整倍體的細(xì)胞系，因?yàn)閷?duì)后者進(jìn)行遺傳和生化分析較困難。 必須注意染色體的倍數(shù)性水平：在離體選擇隱性突變的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)盡量使用單倍體材料。但是單倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)不穩(wěn)定，易產(chǎn)生多倍體。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖谦@得顯性突變或胞質(zhì)突變，就不一定使用單倍體細(xì)胞系。 培養(yǎng)細(xì)胞再生植株的能力：如果親本細(xì)胞系不能再生植株，從其中篩選出來(lái)的變異細(xì)胞系很可能不能再生植株。故要使用再生能力強(qiáng)的細(xì)胞系。,2、培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響,方式：愈傷組織、細(xì)胞懸浮、細(xì)胞固體和原生質(zhì)體培養(yǎng)。 （1）、愈傷組織培養(yǎng)：最常用。但存在如下缺點(diǎn)： 和懸浮培養(yǎng)相比，愈傷組織

14、的生長(zhǎng)速率比較慢，這在某些生化突變體的選擇實(shí)驗(yàn)中，可能會(huì)產(chǎn)生不利的結(jié)果。 一塊愈傷組織中的細(xì)胞不可能均勻地受到選擇壓力的作用，貼近培養(yǎng)基表面的細(xì)胞受到的選擇壓力較大； 在一塊愈傷組織中，細(xì)胞之間的接觸相當(dāng)緊密，很容易產(chǎn)生互饋?zhàn)饔?，使它們有可能逃脫選擇壓力的作用； 個(gè)別突變細(xì)胞由于周?chē)罅糠峭蛔兗?xì)胞的影響，很難生長(zhǎng)。 存活的愈傷組織很可能是嵌合體，其中有大量細(xì)胞可能只是簡(jiǎn)單地逃脫了選擇壓力的作用，而并非是所需要的突變體。,（2）、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式：細(xì)胞生長(zhǎng)較為迅速，但細(xì)胞團(tuán)大小不一，過(guò)大者由于其內(nèi)、外層細(xì)胞所處的環(huán)境差別較大，所受到的選擇壓力可能不同，不利于優(yōu)良細(xì)胞的篩選。 方法：可用適當(dāng)孔徑篩

15、網(wǎng)過(guò)濾，以除去較大的細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)往往與細(xì)胞固體培養(yǎng)結(jié)合起來(lái)，以達(dá)到較好的篩選效果。 （3）、原生質(zhì)體培養(yǎng)物：理論上講是用于篩選突變體的最理想材料。可從植株或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離原生質(zhì)體，都可得到單細(xì)胞群體，在誘變劑處理和選擇劑使用時(shí)比較均勻，細(xì)胞團(tuán)和再生植株均來(lái)自于單個(gè)細(xì)胞，因此不可能形成嵌合體。,3、細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響 細(xì)胞生長(zhǎng)速度可能會(huì)影響離體分離突變體的成敗。一些抗代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)基中只有很短的半衰期。如果有關(guān)的細(xì)胞系生長(zhǎng)很慢，那么抗代謝產(chǎn)物可能在敏感細(xì)胞死亡前降解。因此，敏感的變異體可能會(huì)在不允許其生長(zhǎng)的條件下存活下來(lái)。生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞也易發(fā)生染色體變化。 4、選擇壓力的

16、施加方式對(duì)細(xì)胞篩選效果的影響 選擇壓力可一次性，也可以逐步施加。有的情況下，選擇壓力的施加方式直接影響選擇的成敗。例如，如果選擇一個(gè)細(xì)胞器基因突變，最好采用逐步施加的方式。,第三節(jié) 植物細(xì)胞的誘變,誘變是指通過(guò)各種誘變劑的作用，使細(xì)胞發(fā)生變異的過(guò)程。 一、誘變劑 物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩大類(lèi)。 1、物理誘變劑 包括X射線、射線、中子、粒子、粒子、紫外線等。紫外線的能量較低，不能引起被照射物質(zhì)的離子化，叫做非電離誘變因子；其余物理誘變劑均能引起被照射物質(zhì)的離子化，稱(chēng)為電離誘變因子。,物理誘變,選擇輻射類(lèi)型應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)類(lèi)型進(jìn)行。 以組織器官為誘導(dǎo)材料，可以選擇輻射強(qiáng)度較大的射線、快中子等進(jìn)行輻射。

17、以細(xì)胞或原生質(zhì)體，則可以選擇X射線、紫外線等。特別是以原生質(zhì)體為誘導(dǎo)材料，可以使用紫外線照射，因?yàn)槌Ｓ米贤饩€的波長(zhǎng)為270nm，與DNA吸收波長(zhǎng)260nm相近，而原生質(zhì)因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞壁的屏障，對(duì)紫外線的敏感性較強(qiáng)，從而可以達(dá)到較好的誘變效果。,采用物理誘變劑處理的方法： 外照射：射線由被照射物質(zhì)的外部透入內(nèi)部誘發(fā)突變。這種方法比較簡(jiǎn)單安全，可進(jìn)行大量處理。又分為急照射和慢照射，前者指在較短時(shí)間內(nèi)把全部劑量照完，后者指在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)照射完全部劑量。 內(nèi)照射：將放射源引入到植物組織或細(xì)胞內(nèi)使其放出射線誘發(fā)突變。常用的有浸泡法、注射法和飼入法。,2、化學(xué)誘變劑,主要分三類(lèi)，包括堿基類(lèi)似物、烷化劑、疊氮化

18、合物。此外一些抗菌素也可以作為誘變劑。 作用機(jī)理： (1)在DNA復(fù)制時(shí)，誘發(fā)配對(duì)錯(cuò)誤：堿基類(lèi)似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶類(lèi)似物，2氨基嘌呤是腺嘌呤類(lèi)似物等），在細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制時(shí)，這些類(lèi)似物可以摻入到新合成的DNA分子中引起錯(cuò)配； (2)誘發(fā)染色體斷裂 (3)改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)：烷化劑（硫酸二乙酯 DES，乙基磺酸乙酯 EES，甲基磺酸乙酯 EMS，環(huán)氧乙烷EO，乙烯亞胺 EI），此類(lèi)誘變劑有一個(gè)或多個(gè)活化烷基，可與DNA分子中的堿基或磷酸基結(jié)合，改變DNA的結(jié)構(gòu)而引起突變。,2、化學(xué)誘變劑,為什么雙功能和多功能烷化劑的毒性要比單功能烷化劑強(qiáng)，對(duì)改變DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的誘變力也大？ 烷化劑的活烷基

19、能夠轉(zhuǎn)移到其他分子中電子密度極高的位置上去。這種通過(guò)烷基在分子內(nèi)的置換作用稱(chēng)為烷基化作用。烷化劑通過(guò)對(duì)磷酸基、嘌呤、嘧啶基的烷基化而與DNA作用，最終生物學(xué)結(jié)果是引起遺傳物質(zhì)的破壞、修復(fù)與錯(cuò)誤修復(fù)。 烷化劑使用含量：甲基磺酸乙酯0.31.5%、乙烯亞胺0.050.15%、亞硝基乙基脲烷0.010.03%、硫酸二乙酯0.10.6%。,二、誘變的基本過(guò)程,單細(xì)胞制備預(yù)培養(yǎng)誘發(fā)突變突變細(xì)胞株的選擇 1、制備單細(xì)胞 (1)材料的選擇：用于突變體篩選的最理想的材料為單細(xì)胞或原生質(zhì)體。也可以用莖尖、腋芽等，但容易誘發(fā)嵌合體，目前用得最多的材料是愈傷組織。 (2)預(yù)處理：根據(jù)植物種類(lèi)需對(duì)誘變劑的含量、時(shí)間進(jìn)

20、行篩選，選用最適含量、最適處理時(shí)間。 (3)細(xì)胞材料的制備：愈傷組織，振蕩培養(yǎng)，獲得小細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物。,2、預(yù)培養(yǎng)： 3、誘發(fā)突變 一般采用平板培養(yǎng)法，并在培養(yǎng)基中加入某種選擇因子，長(zhǎng)時(shí)間飼喂，使細(xì)胞發(fā)生擬定目標(biāo)的突變。 4、突變細(xì)胞的選擇 將在具有選擇因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)月的細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)入不加選擇因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，數(shù)周后，再轉(zhuǎn)入具有選擇因子的培養(yǎng)基上，選擇能旺盛分裂的細(xì)胞團(tuán)(或細(xì)胞株)，說(shuō)明該細(xì)胞團(tuán)具有抗某種選擇因子的突變細(xì)胞株。 5、突變細(xì)胞的遺傳分析和鑒定. 生化分析、細(xì)胞學(xué)觀察、性狀分析。分析突變是屬于遺傳的變異，還是屬于非遺傳的。,第四節(jié) 植物原生質(zhì)體融合,兩種異源(種、

21、屬間)原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑的誘發(fā)下，相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合形成融合體，再經(jīng)過(guò)細(xì)胞壁再生形成雜種細(xì)胞的過(guò)程，稱(chēng)為原生質(zhì)體融合或稱(chēng)為細(xì)胞融合。 受精作用是一種自發(fā)的融合，而原生質(zhì)體由于質(zhì)膜表面帶有負(fù)電荷，它們之間通常是相互排斥的，所以自然融合頻率極低。所以要采用一定的方法加以誘導(dǎo)以促進(jìn)原生質(zhì)體的融合。,理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。 融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體

22、、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。,幾個(gè)重要進(jìn)展,1960年，Cocking用酶法制備高等植物原生質(zhì)體首次獲得成功； 1970年，Power首次用硝酸鈉為誘導(dǎo)劑進(jìn)行了較大規(guī)模的原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合； 1971年，Takebe首次從離體煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)中獲得再生完整植株； 1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的細(xì)胞雜種，這也是第一個(gè)植物細(xì)胞雜種； 1974年，Kao將聚乙二醇誘導(dǎo)融合法應(yīng)用于植物細(xì)胞融合并建立了相應(yīng)的融合技術(shù)； 1978年，Melchers獲得了第一個(gè)屬間細(xì)胞雜種（番茄馬鈴薯）； 1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念

23、； 1987年，Schweiger建立了單對(duì)原生質(zhì)體電融合技術(shù)程序。,Genetic Transfer in Plants through Interspecific Protoplast Fusion,根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類(lèi)： 對(duì)稱(chēng)融合：兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。 非對(duì)稱(chēng)融合：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合，它可以分為幾種。(親本供體僅以胞質(zhì)基因或部分核基因轉(zhuǎn)移到受體一方 ),用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類(lèi)：,物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活； 化學(xué)處理目前常用的試劑有： 核失活：碘乙酰胺（I

24、OA）、碘乙酸(Iodoacetate)； 質(zhì)失活：羅丹明（R-6-G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過(guò)程而達(dá)到失活作用。,體細(xì)胞融合與有性雜交的比較,2、細(xì)胞融合情況,1、正反有性雜交情況,原生質(zhì)體的融合過(guò)程包括三個(gè)主要階段： 一是凝聚作用階段，其間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近； 二是在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個(gè)原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋； 三是由于細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。,一、原生質(zhì)體融合的方法,1. 無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合 用來(lái)做融合劑的無(wú)機(jī)鹽是硝酸鈉。 1972年Carlson就是用它來(lái)融合煙草的原生質(zhì)體，并

25、首次獲得種間的體細(xì)胞雜種。 原理：硝酸鈉中和了質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起。但硝酸鈉對(duì)原生質(zhì)體有害作用，且誘導(dǎo)頻率也很低，所以目前很少有人采用。,2.PEG誘導(dǎo)融合法 PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：用此方法的誘導(dǎo)頻率可以高達(dá)10-50%。并無(wú)種屬特性，幾乎可以誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體之間的融合。優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。缺點(diǎn)是過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 作用機(jī)理： 由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG能增加類(lèi)脂膜的流動(dòng)性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。,方法： （1）以常規(guī)的方法收集原生質(zhì)體，將兩親本的原生質(zhì)體高密度等體積混合。 （2）滴3滴混合的原生質(zhì)體懸浮液于載玻片上，放置10分鐘。 （3）加PEG 450L。 PEG的制備方法：1gPEG加入pH5.5的2ml的0.1mol/L的葡萄糖、0.5mmol/LCaCl