基因組DNA提取與PCR技術

1、.,基因組DNA提取與PCR技術,李兆陽,.,前言,在基因工程和蛋白質(zhì)工程中，核酸分子是這些技術應用所涉及的主要對象，所以核酸的分離與提取是分子生物學研究中很重要的基本技術。核酸樣品的質(zhì)量將直接關系到實驗的成敗。,.,主要內(nèi)容,基因組DNA提取 1、核酸的分類及理化性質(zhì) 2、幾種核酸提取方法的基本原理及實 例分析 3、常見問題與對策,.,核酸分為兩大類,脫氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。,.,脫氧核糖核酸（DNA）,DNA分子含有生物物種的所有遺傳信息，分子量一般都很大 DNA結構,.,核糖核酸（RNA）,

2、RNA主要是負責DNA遺傳信息的翻譯和表達，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子。,.,核酸的理化性質(zhì),RNA核苷酸的純品呈白色粉末或結晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。,.,核酸的理化性質(zhì),天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細胞核中。要從細胞中提取DNA 時，

3、先把DNP抽提出來，再把P除去，再除去細胞中的糖，RNA 及無機離子等，從中分離DNA 。,.,核酸的理化性質(zhì),DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。 RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時， 常用此法分離這兩種核蛋白。,.,DNA提取的幾種方法 (1).濃鹽法,利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯

4、化鈉提取液抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積無水乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來. 也可用0.15MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿-異戊醇法除去蛋白. 兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.,.,（2）陰離子去污劑法,SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸,.,基因組DNA-SDS法,以動物組織為例,.,（3）苯酚氯仿抽提法,苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降

5、解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA聯(lián)結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。 此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài) .,.,（4）水抽提法:,利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積無水乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用70%、80%和95%乙醇洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.,.,幾種方法的比較苯酚、氯仿抽提/醇沉淀方法,是

6、一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便 。苯酚、氯仿抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。 關鍵 ：酚氯仿要混勻徹底，用量足夠。,.,濃鹽法,高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與酚氯仿抽提方法相比，純度的穩(wěn)定性可能要低一點。 更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提。 不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。,.,水沉淀,此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.,.,實例分析,從鼠尾組織中提取基因組DNA,.,棄上清,12000rpm 10min,12000rpm 10mi

7、n,12000rpm 10min,4度保存,PK、SSTE 55度,流程圖,.,DNA中含有蛋白、多糖、酚類雜質(zhì) DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶切和PCR反應 DNA中殘留有金屬離子,重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì) 重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)后再溶解。 增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）,DNA提取常見問題,問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶切和PCR反應。,原因,對 策,.,材料不新鮮或反復凍融 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷 外源核酸酶污染 反復凍融,盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的D

8、NA時，可增加裂解液中螯合劑的含量 操作應盡量輕柔 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌 將DNA分裝保存于TE緩沖液中，避免反復凍融,DNA提取常見問題,問題二：DNA降解。,對 策,原因,.,實驗材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗滌時DNA丟失,盡量選用新鮮（幼嫩）的材料適當增加用量. 高溫裂解時,時間適當延長，適當增加PK的用量。 低溫沉淀,延長沉淀時間 注意動作輕柔,避免丟失。,DNA提取常見問題,問題三：DNA提取量少。,對 策,原因,.,DNA電泳圖,.,PCR技術,1、PCR發(fā)展歷史 2、PCR原理及引物設計基本原則 3、常見問題與注意事項 4、PCR技術的發(fā)展,.

9、,PCR發(fā)展歷史,PCR的設想 本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆目的片段”。 PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件-模板DNA,引物,DNA聚合酶,合適的緩沖體系;DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。,.,一、PCR的基本原理,DNA的復制 (replication) 由親代D

10、NA合成兩個相同的子代 DNA的過程。,.,基本原理：,在模板、引物、4種dNTP和Taq DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應。,.,基本步驟,變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂?退火：降溫使引物和互補模板在局部形成雜交鏈 延伸：耐熱DNA聚合酶按53方向催化以引物為起始點的延伸反應,.,一、PCR的基本原理示意圖,Flash演示,.,二、PCR引物設計 PCR反應成功擴增的一個關鍵條件在于引物的正確設計。引物設計的總原則就是提高擴增的效率和特異性。 其效率和特異性取決于兩個方面，一是引物與模板的特異結合，二是聚合酶對引物的有效延伸。,.,1、引物長度

11、一般為1530個核苷酸。 2、引物中的堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3端不應有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物中G+C的含量在4555%左右。設計引物時要考慮3端和5端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54C 3、引物自身內(nèi)部不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結構。 4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其應避免3端的互補重疊。,（一）PCR引物設計原則,.,5、引物的堿基序列不應與非擴增區(qū)域有同源性。尤其是引物3末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性

12、擴增。 6、引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。,.,7、引物的5端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標記，加入其它短序列包括起始密碼子，終止密碼子等。在PCR的起始反應中，引物5端游離的堿基并不影響引導新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以這種引物參與的PCR反應產(chǎn)物，既含有目的擴增片段又含有兩側引入的核苷酸序列。,.,（二）引物設計的方法,現(xiàn)在PCR引物設計大都通過計算機軟件進行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟?/p>

13、網(wǎng)頁，在線引物設計的網(wǎng)站有： http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgiwww.cgi; /cgi-bin/SGD/web-primer; http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi; /urolab/methprimer/index1.html; /rawprimer.html,.,10擴增緩沖液 10ul 4種dN

14、TP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul,標準的PCR反應體系,.,PCR反應條件的控制,PCR反應成分 1.PCR反應的緩沖液：10-50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72 時pH7.2,調(diào)節(jié)反應體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50mmol/L的KCl可促進引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級結構。,.,Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 濃度

15、過低，會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。Mg2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴增片段的產(chǎn)率。 在PCR反應中，Mg2+的總量應比dNTPs的濃度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基團可與Mg2+結合而降低游離Mg2+濃度，從而影響Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。,2.鎂離子濃度：1.5mmol/L,.,dNTP溶液具有較強的酸性。使用時應用NaOH將pH值調(diào)至7.0-7.5，分裝小管，于-20存放，過多凍融會使dNTP產(chǎn)生降解。 在PCR反應中，dNTPs濃度在20-200mol/L, dNTP濃度

16、過高可加快反應速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本。反之，低濃度的dNTP會導致反應速度的下降，但可提高反應的特異性及實驗的精確性。4種dNTP在使用時必須以等摩爾數(shù)濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率。,3.底物濃度：20-200mol/L,.,在PCR反應中，DNA聚合酶是最關鍵的因素之一。PCR發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應用。直到耐熱的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 應用于PCR反應，才使這一技術得到迅速發(fā)展和廣泛應用。,4.耐熱DNA聚合酶：2.5-5 u,.,Ta

17、qDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80具有最高的聚合酶活性。75-80每個酶分子每秒可延伸約150個核苷酸，70時延伸速度在60個核苷酸/秒以上。55時為22個核苷酸/秒；37和22時分別為1.5個和0.25個核苷酸/秒。溫度超過80時，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結合穩(wěn)定性遭到破壞有關。,.,Taq DNA聚合酶沒有35外切酶活性。沒有校正功能。對于30次循環(huán)的PCR擴增反應。此酶的錯配率為0.1%0.25%。Taq DNA聚合酶體外擴增DNA的忠實性是所有已知忠實性的DNA聚合酶中最低的。因此在特別考慮擴增產(chǎn)物忠實性，推薦采用具有校對功能的其他耐熱的DNA聚合酶。如Vent

18、和Pfu DNA聚合酶。,.,Taq DNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端。但對4種dNTP聚合到3-未端的能力不同，對dATP的聚合能力高于其他3種核苷酸，因此PCR產(chǎn)物的末端總是帶有兩個A。我們利用它的這種特性，在構建T載體時，在反應體系 中只加一種底物，即只加dTTP。此酶就催化在載體末端加上dT,這種載體即可直接用來克隆PCR 產(chǎn)物。,.,5.引物：0.1-0.5 mol/L PCR反應引物濃度為0.1-0.5mol/L,引物與模板的摩爾比至少為108：1。如此過量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會引

19、起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴增效率。但如果該比例太低，PCR效率也會降低。,.,6.模板,在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，但模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。為保證反應特異性，一般采用微克水平的基因組DNA或102105拷貝的待擴增片段作為模板,.,(二)循環(huán)參數(shù) 變性溫度和時間：按模板DNA復雜程度來調(diào)整變性溫度和時間。94 ，1min；95 ，30 s ；97 ，15 s ； 退火溫度和時間：45-55 ，30s-1min 延伸溫度和時間：72 ，時間因擴增片段的長度而異：1kb，1min；3-4kb,3-4min 循環(huán)次數(shù)：25

20、-30次，視最初靶分子濃度而定,.,（三）PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律,在PCR反應中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學原理。反應初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達到一定比例時，酶的催化反應趨于飽和，此時擴增DNA片段的增加減慢進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應”，又稱“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進行25次以上PCR循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應中不可避免。,.,PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖,.,PCR實驗中應注意的事項,由于PCR反應極強的擴增能力和檢測的靈敏性，微量樣品的污染便有可能導致假陽性結果的出現(xiàn).所以PCR操作過程中需要注意很多細節(jié).,.,(一）PCR實驗室的設置 樣品制備區(qū)：,這個區(qū)域?qū)ｉT用于制備模板，要求：PCR產(chǎn)物和帶有待擴增序列的DNA克隆不能在這個區(qū)域操作，用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取DNA樣品和RNA樣品時要帶手套，并要經(jīng)常更換。,.,PCR操作區(qū)：,PCR儀應單獨放在另一間實驗室。另外，在PCR反應前應對準備和保持干凈的PCR成分給予高度重視。所用的所有溶液應該沒有核酸和核