CTAB法提取細(xì)菌Total_DNA原理

1、CTAB法提取細(xì)菌Total DNA原理CTAB法原理 CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。陽離子表面活性劑，呈白色或淺黃色結(jié)晶體至粉末狀。易溶于異丙醇，可溶于水，熔于熱水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方：Tris-HCl (pH8.0)

2、提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 1.用酚抽提細(xì)胞DNA時(shí)，有什么作用？使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，

3、而DNA溶于水相。 使用酚的優(yōu)點(diǎn):有效變性蛋白質(zhì)； 抑制了DNase的降解作用。 缺點(diǎn)：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。2.氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）3. 用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？ 減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡；降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生；另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4.用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽離子？ 用乙醇

4、沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽離子，如NaCl 或 NaAc（20mmol/L？）Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。在DNA提取過程中應(yīng)做到：1、根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提，在單價(jià)陽離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。真核生物中

5、的染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結(jié)合，形成核蛋白（DNA），存在于核內(nèi)。DNA在低濃度NaCl中，隨NaCl濃度升高，溶解度降低，但升高到0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度又隨著濃度升高而增大，至1mol/L氯化鈉中的溶解度比純水高2倍。DNA溶于濃鹽溶液（如1mol/L的NaCl），但不溶于生理鹽溶液（0.14mol/L的NaCl）。RNA在0.14mol/L的NaCl中溶解度相當(dāng)大，因此可以以0.14mol/L的NaCl把DNA和RNA分開。真核生物中，DNA總是與纏繞的組蛋白同時(shí)存在，而原核生物的DNA卻是單獨(dú)存在的。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿

6、等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。真核生物DNA提取先將細(xì)胞破壁，用濃鹽溶液提取，再稀釋到0.14mol/L的鹽溶液，使DNP沉淀出來；再溶解沉淀多次以純化；用苯酚多次抽提，去除蛋白。用水飽和的苯酚與DNP一起振蕩、離心，不溶性的變性蛋白在中間界面，DNA溶于上層，部分變性蛋白溶于苯酚。將含DNA的水相，在鹽存在的條件下，用乙醇等將DNA沉淀出來。用乙醚或乙醇洗DNA1。微生物DNA提取常規(guī)的微生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的具體特點(diǎn)選擇合適的方法3 。對(duì)真菌DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞，通常采取酶解破壁法或物理破壁法（以液氮冷凍