微生物代謝工程答案

1、1. 微生物代謝工程定義、研究?jī)?nèi)容和研究手段。定義：通過(guò)某些特定生化反應(yīng)的修飾來(lái)定向改善細(xì)胞的特性功能，運(yùn)用重組DNA技術(shù)來(lái)創(chuàng)造新的化合物。研究?jī)?nèi)容：生物合成相關(guān)代謝調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)理論；代謝流的定量分析；代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計(jì)；中心代謝作用機(jī)理及相關(guān)代謝分析；基因操作。研究手段：代謝工程綜合了基因工程、微生物學(xué)、生化工程等領(lǐng)域的最新成果。因此，在研究方法和技術(shù)方面主要有下列三大常用手段：(1)檢測(cè)技術(shù)：常規(guī)的化學(xué)和生物化學(xué)檢測(cè)手段都可用于代謝工程的研究，如物料平衡、同位素標(biāo)記示蹤法、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析法、光譜學(xué)法、生物傳感器技術(shù)。(2)分析技術(shù)：采用化學(xué)計(jì)量學(xué)、分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和化學(xué)工程學(xué)的研究方法

2、并結(jié)計(jì)算機(jī)技術(shù)，闡明細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)特征與控制機(jī)理，如穩(wěn)態(tài)法、擾動(dòng)法、組合法和代謝網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化等。(3) 基因操作技術(shù)：在代謝工程中，代謝網(wǎng)絡(luò)的操作實(shí)質(zhì)上可以歸結(jié)為基因水平上的操作：涉及幾乎所有的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如基因和基因簇的克隆、表達(dá)、調(diào)控，DNA 的雜交檢測(cè)與序列分析，外源DNA的轉(zhuǎn)化，基因的體內(nèi)同源重組與敲除，整合型重組DNA 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定維持等。2. 代謝改造思路和代謝設(shè)計(jì)原理。代謝改造思路：根據(jù)微生物的不同代謝特性，常采用改變代謝流、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑三種方法。(1)改變代謝途徑的方法：加速限速反應(yīng)，增加限速酶的表達(dá)量，來(lái)提高產(chǎn)物產(chǎn)率。改變分支代謝途徑流

3、向，提高代謝分支點(diǎn)某一分支代謝途徑酶活力，使其在與其它的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。(2)擴(kuò)展代謝途徑的方法：在宿主菌中克隆和表達(dá)特定外源基因，從而延伸代謝途徑，以生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物和提高產(chǎn)率。擴(kuò)展代謝途徑還可使宿主菌能夠利用自身的酶或酶系消耗原來(lái)不消耗的底物。(3)轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑：通過(guò)轉(zhuǎn)移代謝途徑、構(gòu)建新的代謝途徑等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。代謝設(shè)計(jì)原理：現(xiàn)存代謝途徑中改變?cè)黾幽康漠a(chǎn)物代謝流：增加限速酶編碼基因的拷貝數(shù)；強(qiáng)化關(guān)鍵基因的表達(dá)系統(tǒng)；提高目標(biāo)途徑激活因子的合成速率；滅活目標(biāo)途徑抑制因子的編碼基因；阻斷與目標(biāo)途徑相竟?fàn)幍拇x途徑；改變分支代謝途徑流向；構(gòu)建代謝旁

4、路；改變能量代謝途徑；在現(xiàn)存途徑中改變物流的性質(zhì)：利用酶對(duì)前體庫(kù)分子結(jié)構(gòu)的寬容性；通過(guò)修飾酶分子以拓展底物識(shí)別范圍；在現(xiàn)存途徑基礎(chǔ)上擴(kuò)展代謝途徑：在宿主菌中克隆、表達(dá)特定外源基因可以延伸代謝途徑，從而生產(chǎn)新的代謝產(chǎn)物、提高產(chǎn)率。3. 微生物的基因操作技術(shù)有哪些？（舉兩例說(shuō)明） 微生物的基因操作技術(shù)有：核酸的凝膠電泳、核酸的分子雜交技術(shù)、DNA序列分析、基因的定點(diǎn)誘變、細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、利用DNA與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行核酸研究、PCR技術(shù)等?；蚨c(diǎn)突變(site-directed mutagenesis)：通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，用于研究氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化

5、活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。主要采用兩種PCR方法，包括重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法。在硫化細(xì)菌核苷水解酶對(duì)底物專(zhuān)一性的研究中，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)編碼221位和228位氨基酸的DNA序列進(jìn)行突變，改變兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸，從而研究氨基酸殘基對(duì)底物結(jié)合的影響。基因敲除(gene knock-out)：又稱基因打靶，通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專(zhuān)一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)，可分為完全基因敲除和條件型基因敲除。在谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)纈氨酸的研究中，采用基因敲除的方法

6、進(jìn)行高產(chǎn)菌株構(gòu)建。如ilvA基因敲除，使蘇氨酸脫氨酶的合成減少，降低異亮氨酸合成的前體，從而減少異亮氨酸的合成，增加纈氨酸的生成。4. 什么是酶的反饋抑制，以纈氨酸代謝途徑來(lái)舉例說(shuō)明。酶的反饋抑制：指最終產(chǎn)物抑制作用，即在合成過(guò)程中有生物合成途徑的終點(diǎn)產(chǎn)物對(duì)該途徑的酶的活性調(diào)節(jié)，所引起的抑制作用，包括順序反饋抑制、同工酶的反饋抑制、協(xié)同反饋抑制、累積反饋抑制、增效反饋抑制。以纈氨酸為例：纈氨酸由丙酮酸合成，涉及四個(gè)反應(yīng)，分別由四個(gè)酶催化，依次為乙酰羥酸合酶(AHAS)、乙酰羥酸同分異構(gòu)酶(AHAIR)、二羥酸脫水酶(DHAD)和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA)。首先，由AHAS將兩分子丙酮酸縮合成2-

7、乙酰乳酸；其次，AHAIR將2-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為雙羥基異戊酸；再次，由DHAD將雙羥基異戊酸脫水形成2-酮異戊酸；最后，TA將2-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-纈氨酸。L-纈氨酸和L-異亮氨酸的合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4種酶。如AHAS以丙酮酸為底物則合成L-纈氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸為底物則合成L-異亮氨酸。纈氨酸合成反饋抑制的主要對(duì)象是其合成途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵酶乙酰羥酸合酶（AHAS），同時(shí)纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個(gè)末端產(chǎn)物纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的多價(jià)阻遏。因此，如果解除AHAS的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為此可選育纈

8、氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株來(lái)解除纈氨酸的反饋調(diào)節(jié)。如抗纈氨酸突變株的獲得，或者利用分子手段對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。5. 微生物酶的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式（舉兩例說(shuō)明）。微生物并不是在所有空間、時(shí)間內(nèi)合成它所能合成的全部酶，在一定生理?xiàng)l件下只合成它當(dāng)時(shí)所需要的酶，且酶的活力受到控制。微生物主要在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白質(zhì)水平、不同空間分布和細(xì)胞水平上進(jìn)行酶的調(diào)節(jié)，此外對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的響應(yīng)也起到調(diào)節(jié)作用。（1）以轉(zhuǎn)錄水平上營(yíng)養(yǎng)阻遏機(jī)制為例來(lái)說(shuō)明酶的調(diào)節(jié)： 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是通過(guò)調(diào)節(jié)酶量進(jìn)行的。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)基中含有能被細(xì)胞迅速利用的碳源（如葡萄糖）時(shí)，其在降解過(guò)程中的某代謝產(chǎn)物阻遏了其余降解酶系的合成

9、，這種現(xiàn)象被稱為“降解物阻遏”。 環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）能與環(huán)腺苷酸（cAMP）結(jié)合形成cAMP-CRP復(fù)合物。當(dāng)cAMP-CRP結(jié)合于DNA時(shí)，能促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。葡萄糖分解代謝物能抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并活化磷酸二酯酶，從而降低cAMP濃度，不能形成cAMP-CRP復(fù)合物，降低了各種酶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，起到調(diào)節(jié)相關(guān)代謝酶的作用。（2）以蛋白質(zhì)水平上酶的共價(jià)修飾為例來(lái)說(shuō)明酶的調(diào)節(jié)：酶的共價(jià)修飾時(shí)調(diào)節(jié)酶活性的重要方式，通過(guò)其他酶對(duì)多肽鏈上某些基團(tuán)進(jìn)行可逆的共價(jià)修飾，使處于活性與非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶的活性，如磷酸化、腺苷?；?、甲基化等。磷酸化酶激酶催化的反應(yīng)既可

10、以是通過(guò)磷酸化作用使無(wú)活性的磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為有活性的磷酸化酶a ，也可以是通過(guò)磷酸化酶磷酸酶的水解作用使磷酸化酶a脫去磷酸而轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的磷酸化酶b。6. 微生物基因水平的調(diào)控策略，請(qǐng)舉例說(shuō)明 基因調(diào)控是生物體內(nèi)控制基因表達(dá)的機(jī)制。基因表達(dá)的主要過(guò)程是基因的轉(zhuǎn)錄和信使核糖核酸(mRNA)的翻譯?；蛘{(diào)控主要發(fā)生在三個(gè)水平上,即DNA水平上的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄控制和翻譯控制；微生物通過(guò)基因調(diào)控可以改變代謝方式以適應(yīng)環(huán)境的變化，這類(lèi)基因調(diào)控一般是短暫的和可逆的；多細(xì)胞生物的基因調(diào)控是細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生和個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ),這類(lèi)調(diào)控一般是長(zhǎng)期的,而且往往是不可逆的?；蛘{(diào)控的研究有廣泛的生物學(xué)意義，是發(fā)生遺傳學(xué)

11、和分子遺傳學(xué)的重要研究領(lǐng)域。原核生物的基因調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。根據(jù)調(diào)控機(jī)制的不同可分為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。真核生物的基因調(diào)控比原核生物復(fù)雜得多。(1)負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)：大腸桿菌的lac i基因與乳糖操縱子（lactose operon）的作用是典型的負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，i基因是調(diào)節(jié)基因，當(dāng)它的產(chǎn)物阻遏蛋白與操縱區(qū)（lac O）結(jié)合時(shí)，RNA聚合酶便不能轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因，因此，在環(huán)境中缺乏誘導(dǎo)物（乳糖或IPTG）時(shí)，乳糖操縱子是受阻的。而當(dāng)環(huán)境中有乳糖時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞的乳糖在細(xì)胞內(nèi)尚存在的極少量的-半乳糖苷酶的作用下而發(fā)生分子重排，由乳糖變成異乳糖，異乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白緊密結(jié)合，使后

12、者的構(gòu)型發(fā)生改變而不能識(shí)別lac O，也不能與之結(jié)合，因而RNA聚合酶能順利轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因，形成大分子的多順?lè)醋觤RNA，繼而在翻手水平上合成三種不同的蛋白質(zhì)：-半乳糖苷酶、透性酶以及乙?；D(zhuǎn)移酶。（2）負(fù)控阻遏系統(tǒng)：大腸桿菌色氨酸操縱子（tryptophan operon）含有5個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼色氨酸生物合成途徑中的 5種酶。這些基因從一個(gè)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄出一條多順?lè)醋拥膍RNA，與lac操縱子一樣，這個(gè)啟動(dòng)子受毗鄰的操縱區(qū)順序控制。轉(zhuǎn)錄是通過(guò)操縱區(qū)和阻遏蛋白控制的，它的效應(yīng)物分子是色氨酸，也就是由tr操縱子的基因所編碼的生物合成途徑中的末端產(chǎn)物。當(dāng)色氨酸很豐富時(shí)，它結(jié)合到游離的阻遏物上誘發(fā)變構(gòu)

13、轉(zhuǎn)換，從而使阻遏物緊緊結(jié)合在操縱區(qū)。另一方面，當(dāng)色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，阻遏物失去了所結(jié)合的色氨酸，從操縱區(qū)上解離下來(lái)，tr操縱子的轉(zhuǎn)錄就此開(kāi)始。色氨酸起著tr操縱子的輔阻遏物功能。（3）染色質(zhì)丟失：在發(fā)育過(guò)程中一些體細(xì)胞失去了某些基因，這些基因便永不表達(dá)，這是一種極端形式的不可逆的基因調(diào)控。在某些線蟲(chóng)、原生動(dòng)物、甲殼動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的體細(xì)胞有遺傳物質(zhì)丟失現(xiàn)象。在這些生物中，只有生殖細(xì)胞才保留著該種生物基因組的全套基因。例如在馬副蛔蟲(chóng)(Ascaris megacephala)卵裂的早期就發(fā)現(xiàn)有染色體的丟失現(xiàn)象。蜜蜂的工蜂和蜂后是二倍體，而單倍體則發(fā)育成為雄蜂。這也可以認(rèn)為是一種通過(guò)染色體丟失的基因調(diào)控

14、。7. 如何采用代謝工程進(jìn)行纈氨酸育種？答案一纈氨酸生物合成過(guò)程分別由四個(gè)酶催化，分別為乙酰羥酸合酶(AHAS，ilvBN基因產(chǎn)物)、 乙酰羥酸同分異構(gòu)酶(AHAIR，ilvC基因產(chǎn)物)、二羥酸脫水酶(DHAD，ilvD 基因產(chǎn)物)和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TA，ilvE基因產(chǎn)物)。1)纈氨酸生物合成的調(diào)節(jié)，通常采取的方法是用多拷貝質(zhì)粒表達(dá)ilvBNC、ilvD和ilvE基因。2)運(yùn)用啟動(dòng)子的強(qiáng)弱來(lái)控制基因的表達(dá)。這個(gè)策略避免了兩個(gè)極端，避免了太強(qiáng)的基因過(guò)表達(dá)會(huì)對(duì)給菌體本身帶來(lái)壓力，也避免了通過(guò)基因敲除會(huì)徹底切斷支路或者相互競(jìng)爭(zhēng)的路徑帶來(lái)的麻煩。運(yùn)用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，能夠保證涉及生物合成的所有基因都

15、會(huì)表達(dá)在最適宜的代謝流量。3)切斷或改變平行代謝途徑：纈氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑是平行進(jìn)行的，纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成 途徑中公用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進(jìn)而提高纈氨酸的產(chǎn)量。4)解除菌體自身的反饋抑制：纈氨酸合成中的第一個(gè)限速酶乙酰乳酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制，同時(shí)纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個(gè)末端：即纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的多價(jià)阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為

16、此可選育纈氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株來(lái)解除纈氨酸的反饋調(diào)節(jié)。5)增加前體物質(zhì)的合成：生物合成的前體物質(zhì)是丙酮酸，為了積累更多的纈氨酸，必須提高丙酮酸的產(chǎn)量。通過(guò)篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性都可以來(lái)增加丙酮酸的積累。答案二目前，世界利用發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸的出發(fā)菌株有北京棒桿菌（Corynebacterium pekineise）,谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutacium）,乳糖發(fā)酵短桿 (Brevibacterium lactofermentum),大腸桿菌屬（Escherichia coli）, 黃色短桿菌（

17、Brevibacterium flavum）, 粘質(zhì)賽氏桿菌（Serratia marcescens）等，這些菌株均可以作為出發(fā)菌株選育出L-纈氨酸生產(chǎn)菌。工業(yè)發(fā)酵若想獲得較高產(chǎn)量的目的產(chǎn)物，必須突破（或解除）微生物細(xì)胞自我調(diào)節(jié)控制機(jī)制，最常用且最有效的方法就是從遺傳的角度選育解除微生物正常代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的突變株。L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的代謝調(diào)控育種的基本途徑有：切斷或改變平行代謝途徑（選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株），解除菌體自身的反饋抑制（選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株），選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型恢復(fù)突變株，增加前體物質(zhì)的合成，切斷進(jìn)一步代謝途徑和利用基因工程技術(shù)構(gòu)建纈氨酸工程菌。 (1)切斷或改變平行代謝途徑由圖，纈氨酸和

18、異亮氨酸的生物合成途徑是平行進(jìn)行的，纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成途徑中公用了三種酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進(jìn)而提高纈氨酸的產(chǎn)量。同時(shí)-乙酰異戊酸是合成纈氨酸和亮氨酸的共同前體物。切斷亮氨酸的合成途徑不僅可以節(jié)省碳源而且解除了菌體生成纈氨酸酶系的反饋抑制和多價(jià)阻遏，使-異丙基蘋(píng)果酸合成酶脫敏顯著提高纈氨酸的產(chǎn)量。通過(guò)抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性來(lái)切斷與纈氨酸合成無(wú)關(guān)的代謝流分支對(duì)碳源的消耗。使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向纈氨酸。2)解除菌體自身

19、的反饋抑制纈氨酸合成中的第一個(gè)限速酶乙酰乳酸合成酶受纈氨酸的反饋抑制，同時(shí)纈氨酸和異亮氨酸的合成酶系受三個(gè)末端：即纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的多價(jià)阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反饋抑制和纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物酶系的阻遏，必將大大提高纈氨酸的積累。為此可選育纈氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株來(lái)解除纈氨酸的反饋調(diào)節(jié)。常用的纈氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、-氨基丁酸（-AB）、氟亮氨酸、纈氨酸等。(3)增加前體物質(zhì)的合成 由圖可以看出生物合成的前體物質(zhì)是丙酮酸，為了積累更多的纈氨酸，必須提高丙酮酸的產(chǎn)量。通過(guò)篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧

20、化酶（PCx）的活性都可以來(lái)增加丙酮酸的積累。 根據(jù)上述選育突變株的幾條途徑可選育組合型突變株，如營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株和抗性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物雙重突變株，以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。8. 簡(jiǎn)述工業(yè)發(fā)酵的五字策略。（結(jié)合研究實(shí)例說(shuō)明） 工業(yè)發(fā)酵的五字策略為“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”，含義分別為：進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；通，使來(lái)自代謝流上游和各個(gè)“注入分支”的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無(wú)關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物；堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑；出，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。 通：纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成途徑中公用了三種酶，即乙酰

21、乳酸合成酶、乙酰乳酸異構(gòu)還原酶和二羥基脫水酶。選育亮氨酸、異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株可以使用于合成三種氨基酸的公用酶系完全用于纈氨酸的生物合成，進(jìn)而提高纈氨酸的產(chǎn)量。 節(jié)：通過(guò)篩選丙酮酸脫氫酶（PDHC）缺陷菌株來(lái)增加纈氨酸前提物質(zhì)丙酮酸的積累。通過(guò)敲出編碼蘇氨酸脫氫酶的ilvA基因，可以阻斷亮氨酸和泛酸的合成，他們與纈氨酸競(jìng)爭(zhēng)前體物質(zhì)酮異戊酸。通過(guò)抑制醌氧化還原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性來(lái)阻斷與纈氨酸合成無(wú)關(guān)的碳硫分支對(duì)碳源的消耗。阻塞與纈氨酸形成無(wú)關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向纈氨酸堵：纈氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌的育種過(guò)程中，篩選終產(chǎn)物分解抑制菌株，達(dá)到提高產(chǎn)

22、物的目的。出：通過(guò)抑制相應(yīng)運(yùn)輸載體蛋白基因的表達(dá)，從而抑制纈氨酸向胞內(nèi)運(yùn)輸載體蛋白的表達(dá)，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。9 簡(jiǎn)述微生物基因克隆的方法與流程答案一：1. 鳥(niǎo)槍法：將某種微生物的全部基因組切成大小適宜的DNA片段，分別連接到載體DNA上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，從而篩選出含有目的基因的期望重組子?；境绦?）目的基因DNA片段的制備，有機(jī)械法和限制性內(nèi)切酶切割法2）外源DNA片段全克隆3）期望重組子的篩選4）目的基因的定位2. cDNA法：將供體生物細(xì)胞的mRNA分離出來(lái)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成cDNA，并將之克隆在受體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)篩選獲得含有目的基因編碼序列的重組克隆?；?/p>

23、程序：1）mRNA的分離純化雙鏈cDNA的克隆3）cDNA重組克隆的篩選3. PCR擴(kuò)增法：在DNA單鏈模板、引物、DNA聚合酶以及緩沖體系中，根據(jù)生物DNA復(fù)制原理在體外合成DNA。操作步驟：1）將待擴(kuò)增雙鏈DNA加熱變性，形成單鏈模板2）加入兩種不同的單鏈DNA引物，并分別與兩條單鏈DNA模板退火3）DNA聚合酶從兩個(gè)引物的3羥基端按照模板要求合成新生DNA鏈，構(gòu)成一輪復(fù)制反應(yīng)重復(fù)上述操作n次，即可從1分子的雙鏈DNA擴(kuò)增到2n個(gè)分子。4. 化學(xué)合成法：對(duì)于幾十個(gè)堿基的小片段目的基因序列，可以分別直接合成氣兩條互補(bǔ)鏈，然后退火即可。而大片段雙鏈DNA或目的基因合成通常采用單鏈小片段DNA模

24、塊拼接的方法，有三種基本形式，小片段粘接法、補(bǔ)丁延長(zhǎng)法和大片段酶促法。5. 基因文庫(kù)法：將微生物的全部基因分成若干DNA片段，分別與載體DNA在體外拼接成重組分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞中，形成一套含有微生物全基因組的DNA片段克隆，即基因文庫(kù)。這樣就可以從基因文庫(kù)中點(diǎn)出其中任何的DNA片段或目的基因。答案二 方法：基因克隆是指應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量相同的DNA分子拷貝。流程：1) 目的基因的制備：1 基因文庫(kù) ；2 cDNA文庫(kù)。2) 載體的選擇

25、和制備 ：基本要求：.復(fù)制單位;. 克隆位點(diǎn)(多個(gè)單克隆位點(diǎn));. 篩選標(biāo)記;. 分子量盡可能小; . 分子量盡可能小;. 外源DNA插入后不影響載體本身的復(fù)制能力.3) 載體與目的基因的連接-構(gòu)建重組體 ：粘性末端連接法（連接效率高）、去5磷酸連接法、人工接頭法、同聚物接尾法4) 將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 ：1 轉(zhuǎn)化 ：通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過(guò)程。2 感染(infaction)：由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息轉(zhuǎn)移過(guò)程3 轉(zhuǎn)染(transfection)：真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。5) 目的基因的篩選和

26、鑒定 ：免疫學(xué)方法；分子雜交 （探針）；原位雜交； PCR；限制性酶切圖譜；遺傳學(xué)方法插入滅活法(insertion inactivation):抗藥性標(biāo)志選擇（藍(lán)白斑篩選）。10.工業(yè)生物技術(shù)中亟待解決的技術(shù)問(wèn)題有哪些，請(qǐng)舉例說(shuō)明答案一工業(yè)生物技術(shù)是指在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中以微生物或酶為催化劑進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，大規(guī)模地生產(chǎn)人類(lèi)所需的化學(xué)品、醫(yī)藥、能源、材料等產(chǎn)品的生物技術(shù)，它是人類(lèi)由化石經(jīng)濟(jì)向生物經(jīng)濟(jì)過(guò)渡的必要工具，是解決人類(lèi)目前面臨的資源、能源及環(huán)境危機(jī)的有效手段。工業(yè)生物技術(shù)存在著一些關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題亟待解決，目標(biāo)是大大提高工業(yè)生物技術(shù)的效能。1.微生物資源庫(kù)和微生物功能基因組學(xué)技術(shù)：微生物菌種或

27、酶是工業(yè)生物技術(shù)的基礎(chǔ)。從自然界中篩選所需要的菌種是目前工業(yè)生物技術(shù)的主要特點(diǎn)，大部分成功的高產(chǎn)工業(yè)化菌株是從自然界篩選得到的野生型菌株。但是目前人類(lèi)篩選的范圍十分有限，僅占微生物總數(shù)的0.1%1%，需要拓展篩選的范圍。新型生物催化劑的來(lái)源是工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)。正如耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)，才導(dǎo)致了PCR技術(shù)的誕生，從而才會(huì)有今天分子生物學(xué)的巨大成就，并且改變了人類(lèi)的生活面貌。2.生物催化劑快速定向改造新技術(shù)：定向進(jìn)化目前主要研究方向是：提高熱穩(wěn)定性、提高有機(jī)溶劑中酶的活性和穩(wěn)定性，擴(kuò)大底物的選擇性，改變光學(xué)異構(gòu)體的選擇性等。定向進(jìn)化的核心技術(shù)為易錯(cuò)PCR技術(shù)、DNA shuffling技術(shù)及高通量篩選技術(shù)。各類(lèi)工業(yè)微生物的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的飛速發(fā)展，產(chǎn)生了海量信息，隨著高性能計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)管理分析方法的進(jìn)步，大大促進(jìn)了工業(yè)微生物的生物信息學(xué)的發(fā)展，從而使得人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)加深，使得應(yīng)用傳統(tǒng)的理性分子設(shè)計(jì)方法制造新的酶更加容易。這些技術(shù)在增加酶的反應(yīng)多樣性、改變酶的各種性能等方面已有應(yīng)用。3. 重要工業(yè)微生物的代謝工程：隨著對(duì)微生物代謝網(wǎng)