蛋白質和氨基酸性質

1、實驗一 蛋白質與氨基酸的理化性質實驗一、 實驗目的1.了解蛋白質和某些氨基酸的顏色反應原理。2.學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法。3.學習蛋白質等電點的測定。二、 蛋白質的鹽析與變性1.原理在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆?？梢蚴ル姾珊兔撍茐乃瘜雍碗p電層而沉淀。蛋白質的沉淀反應分為可逆反應和不可逆反應兩類。（1）可逆的沉淀反應 此時蛋白質分子的結構尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，沉淀的蛋白質仍能重新溶解于溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用與蛋

2、白質。提純蛋白質時，常利用此類反應分離蛋白質。（2）不可逆的沉淀反應 此時蛋白質分子內部結構發(fā)生重大變化，蛋白質常因變性而發(fā)生沉淀現象，沉淀后的蛋白質不再復溶于同類的溶劑中，加熱引起的蛋白質沉淀與凝固、蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類反應。 有時蛋白質變性后，由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷層），蛋白質并不絮凝析出。因此變性后的蛋白質并不一定都表現出沉淀現象。反之沉淀的蛋白質也未必都已變性。2.試劑與材料（1）蛋白質溶液5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液 500ml(新鮮雞蛋清：水=1：9)（2）pH4.7乙酸-醋酸鈉的緩沖溶液 100 ml（3）3%硝酸銀溶液 10 ml（

3、4）5%三氯乙酸溶液 50 ml（5）95%乙醇 250 ml（6）飽和硫酸銨溶液 250 ml（7）硫酸銨結晶粉末 1000g（8）0.1mol/L鹽酸溶液 300 ml（9）0.1mol/L氫氧化鈉溶液 100ml（10）0.05mol/L碳酸鈉溶液 100ml(11)0.1mol/L乙酸溶液 100ml（12）2%氯化鋇溶液 150 ml 3.實驗步驟（1）蛋白質的鹽析 加入無機鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液后，蛋白質水溶液溶解度發(fā)生變化，過飽和的蛋白質會發(fā)生絮凝沉淀，這種加入鹽溶液或固體鹽能析出蛋白質的現象稱為鹽析。加入的鹽濃度不同，析出的蛋白質現象也不同，人們常用逐步提高蛋白

4、質溶液中鹽濃度的方法，使蛋白質分批沉淀，此類鹽析方法稱為分段鹽析。例如，球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。通過鹽析來制備的蛋白質沉淀物，當加水稀釋降低鹽類濃度時，它又能再溶解，故蛋白質的鹽析作用是一種可逆沉淀過程。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，攪拌均勻后靜置數分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量沉淀物，加少量水，觀察是否溶解，試解釋實驗現象。將試管內沉淀物過濾，向濾液中逐漸添加硫酸銨粉末，并慢速攪拌直到硫酸銨粉末不再溶解為止（飽和狀態(tài)），此時析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白沉淀物，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解現象。（2）重金屬

5、離子沉淀蛋白質 重金屬離子與蛋白質結合成不溶于水的復合物。取1支試管，加入蛋白質溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液12滴，震蕩試管，觀察是否有沉淀產生。放置片刻，傾去上層清液，加入少量的蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。（3）某些有機酸沉淀蛋白質 取1支試管,加入蛋白質溶液2ml，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。（4）有機溶劑沉淀蛋白質 取1支試管，加入2ml蛋白質溶液，再加入2ml95%乙醇。混勻，觀察沉淀的產生。加入少量的蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。三、蛋白質的顏色反應1.雙縮脲反應（1）原理 尿素加熱至180左右，生成雙縮

6、脲并放出一份子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境下能與Cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。因蛋白質分子中有許多肽鍵，也能發(fā)生此反應。雙縮脲反應可用于蛋白質的定性或定量測定。（2）試劑 尿素、10%氫氧化鈉溶液、1%硫酸銅溶液、2%卵清蛋白溶液。（3）實驗步驟 取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素溶化。溶化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，震蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再震蕩。觀察出現的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再

7、加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現。2.茚三酮反應（1）原理 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮成陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸。在定性、定量測定中，應嚴防干擾物存在。在反應十分靈敏，1：1.5106濃度的氨基酸水溶液即能出現該反應，這是一種常用的氨基酸定量測定方法。此反應的適宜pH為57，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。（2）試劑 蛋白質溶液100ml、2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清：水=1：9）、0.5%甘氨

8、酸溶液10ml、0.1%茚三酮水溶液10ml、0.1%茚三酮-乙醇溶液10ml。（3）實驗步驟 取2支試管分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加5ml0.1%茚三酮水溶液，均勻，在沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉色變紫色再變藍。在一小塊濾紙上滴1滴0.5%甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現。3.黃色反應（1）實驗原理 含有苯環(huán)結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數蛋白質分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃

9、色反應。（2）試劑 雞蛋清溶液100ml（將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用6層紗布過濾）、大豆提取液100ml、頭發(fā)、指甲、0.5%苯酚溶液50ml、濃硝酸200ml、0.3%色氨酸溶液10ml、3%酪氨酸溶液10ml、10%氫氧化鈉溶液100ml。（3）實驗步驟 向7個試管中分別按表1加入試劑，觀察各管出現的現象，有的試管反應慢可略放置或用微火加熱。待各管出現黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。表1管號材料（滴）濃硝酸/滴現象1雞蛋清溶液（4）22大豆提取液（4）43指甲（少許）404頭發(fā)（少許）4050.5苯酚（4）460.3%色氨酸（4）470.3%

10、酪氨酸（4）4四、蛋白質等電點的測定（1）原理 蛋白質是兩性電解質。蛋白質分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的pH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液pH成為此種蛋白質的等電點。不同蛋白質各有其特異的等電點。在等電位時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時溶液的pH。本實驗借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用乙酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH的緩沖溶液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖溶液的p

11、H即為酪蛋白的等電點。（2）器材 水浴鍋、溫度計、200ml錐形瓶、100ml容量瓶、吸管、試管、試管架、研缽。（3）試劑 0.4%酪蛋白-醋酸鈉溶液200ml、1.00mol/L乙酸溶液100ml、0.10mol/L乙酸溶液100ml、0.01mol/L乙酸溶液50ml。0.4%酪蛋白-醋酸鈉溶液配制方法：取0.4g酪蛋白，加少量水在研缽中仔細的研磨；將所得的蛋白質懸膠液移入錐形瓶內，用少量4050的溫水洗滌研缽，將洗滌液也移入錐形瓶內；加入10ml 1mol/L醋酸鈉溶液；把錐形瓶放到50水浴中，并小心地旋轉錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止；將錐形瓶內的溶液全部移至100ml容量瓶內，加水至刻度，塞緊玻璃塞，搖勻。（4）實驗步驟取同樣規(guī)格的試管4支，按表2順序分別精確地加入各試劑，然后混勻。表2試管號蒸餾水/ml0.01mol/L乙酸/ml0.01mol/L乙酸/ml1.0mol/L乙酸/ml18.40.628.70.338.01.047.41.6在上表的試管中各加酪蛋白-醋酸鈉溶液1ml，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10min后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點。五、實驗思