農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 NY[共9頁(yè)]

1、農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 NY/T 8832004 1范圍本規(guī)程規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)車(chē)間、菌種、發(fā)酵增殖、后處理、包裝、儲(chǔ)運(yùn)及質(zhì)量檢驗(yàn)等技術(shù)環(huán)節(jié)作出要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB 3095-1996 環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3838-2002 地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)3生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)車(chē)間要求3.1生

2、產(chǎn)環(huán)境 廠區(qū)空氣質(zhì)量達(dá)到大氣環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3095-1996中類標(biāo)準(zhǔn)要求； 發(fā)酵用水達(dá)到地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB 3838-2002中類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)中類水質(zhì)要求；3.2生產(chǎn)車(chē)間 發(fā)酵車(chē)間與吸附等后處理車(chē)間距離適當(dāng)，相對(duì)隔離，有密閉且可以滅菌的傳輸通道； 菌種的儲(chǔ)藏間、無(wú)菌操作間與生產(chǎn)車(chē)間相對(duì)隔離； 發(fā)酵等生產(chǎn)關(guān)鍵性車(chē)間采用雙路供電或備用一套發(fā)電機(jī)。 建立定期用消毒劑進(jìn)行生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的車(chē)間環(huán)境衛(wèi)生制度。4生產(chǎn)技術(shù)流程農(nóng)用微生物菌劑的一般生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)為：菌種種子擴(kuò)培發(fā)酵培養(yǎng)后處理包裝產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)出廠。流程圖見(jiàn)附錄A。4.1菌種4.1.1原種原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對(duì)原種的

3、要求如下： 有菌種鑒定報(bào)告； 菌種的企業(yè)編號(hào)、來(lái)源等信息。4.1.2菌種的保存和管理 采用合適的方式保存菌種，確保無(wú)雜菌污染，菌種不退化。應(yīng)選用一種以上適宜的方法保藏，常見(jiàn)菌種類型及相應(yīng)保藏方式見(jiàn)附錄B； 分類存放，定期檢查； 建立菌種檔案。4.1.3菌種質(zhì)量控制在生產(chǎn)之前，應(yīng)對(duì)所用菌種進(jìn)行檢查，確認(rèn)其純度和應(yīng)用性能沒(méi)有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，需進(jìn)行4.1.4或4.1.5操作。4.1.4菌種的純化菌種不純時(shí)，應(yīng)進(jìn)行純化?？刹捎闷桨鍎澗€分離法或稀釋分離法，得到純菌種。必要時(shí)可采用顯微操作單細(xì)胞分離器進(jìn)行菌種分離純化。對(duì)純化的菌種應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)性能的檢查。4.1.5菌種的復(fù)壯

4、菌種發(fā)生下列現(xiàn)象之一，應(yīng)進(jìn)行菌種復(fù)壯： 菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化； 代謝活性降低，發(fā)酵周期改變； 重要功能性物質(zhì)的產(chǎn)生能力下降； 其他重要特性的退化或喪失；菌種復(fù)壯方法：回接到原宿主或原分離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新分離該菌種。4.2發(fā)酵增殖4.2.1種子擴(kuò)培原菌種應(yīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接活化至生長(zhǎng)旺盛后方可應(yīng)用。種子擴(kuò)培過(guò)程包括試管斜面菌種、搖瓶（或固體種子培養(yǎng)瓶）、種子罐發(fā)酵（或種子固體發(fā)酵）培養(yǎng)三個(gè)階段，操作過(guò)程要保證菌種不被污染、生長(zhǎng)旺盛。4.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基重要原料應(yīng)滿足一定的質(zhì)量要求，包括成分、含量、有效期以及產(chǎn)地等。對(duì)新使用的發(fā)酵原料需經(jīng)搖瓶試驗(yàn)或小型發(fā)酵罐試驗(yàn)后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。4.2.2.1種

5、子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要保證菌種生長(zhǎng)延滯期短，生長(zhǎng)旺盛。原料應(yīng)使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營(yíng)養(yǎng)豐富完全，有較強(qiáng)的pH緩沖能力。最后一級(jí)種子培養(yǎng)基主要成分應(yīng)接近發(fā)酵培養(yǎng)基。4.2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長(zhǎng)旺盛，在保證一定菌體（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顧有效代謝產(chǎn)物。原料應(yīng)選用來(lái)源充足、價(jià)格便宜且易于利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低?？刹捎脤?duì)發(fā)酵培養(yǎng)基補(bǔ)料流加的方法改善培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成以達(dá)到高產(chǎn)。4.2.3滅菌常用的滅菌方式及適用對(duì)象見(jiàn)附錄C。4.2.3.1高壓蒸汽滅菌操作要求a) 液體培養(yǎng)基、補(bǔ)料罐（包括消泡劑）、管道、發(fā)酵設(shè)備及空氣過(guò)濾系統(tǒng)滅菌

6、溫度為121125(壓力0.103Mpa 0.168Mpa)，0.5h1.0h。液體培養(yǎng)基裝料量為50%75%發(fā)酵罐容積。b) 固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121130，1.0h 2.0h；或采用100滅菌2h4h，24h后再滅菌一次。c) 在高溫滅菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)菌體生長(zhǎng)有害物質(zhì)或?qū)σ资芨邷仄茐奈锪蠝缇鷷r(shí)，應(yīng)采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長(zhǎng)時(shí)間。培養(yǎng)基滅菌后按4.2.3.2進(jìn)行檢查。若滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。4.2.3.2滅菌效果檢查采用顯微鏡染色觀察法和/或發(fā)酵管試驗(yàn)法檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。4.2.3.2.1染色觀察法a) 對(duì)待檢測(cè)培養(yǎng)基無(wú)菌操作取樣，在潔凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。b) 若鏡

7、檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認(rèn)為滅菌不徹底，需要進(jìn)行4.2.3.2.2操作，無(wú)活菌體后培養(yǎng)基方可使用。c) 若未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認(rèn)為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時(shí),可進(jìn)行4.2.3.2.2操作，以進(jìn)一步確認(rèn)培養(yǎng)基滅菌徹底。4.2.3.2.2發(fā)酵管試驗(yàn)法用無(wú)菌操作技術(shù)將1mL供試培養(yǎng)基加至5mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，重復(fù)三次。置于37培養(yǎng)，24h內(nèi)無(wú)渾濁、鏡檢無(wú)菌體即可認(rèn)為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。4.2.4無(wú)菌空氣發(fā)酵生產(chǎn)中所通入的無(wú)菌空氣采用過(guò)濾除菌設(shè)備制得，空氣過(guò)濾系統(tǒng)應(yīng)采用二級(jí)以上過(guò)濾。對(duì)制得的無(wú)菌空氣按如下步驟檢驗(yàn)合格后方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。用無(wú)菌操作技術(shù)，向裝有100mL200mL

8、無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測(cè)濾過(guò)空氣10min15min。三角瓶置于37培養(yǎng)，24h內(nèi)無(wú)渾濁、鏡檢無(wú)菌體即判定合格。4.3發(fā)酵控制4.3.1接種量的要求 搖瓶種子轉(zhuǎn)向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為0.5%5%； 在多級(jí)發(fā)酵生產(chǎn)階段，對(duì)生長(zhǎng)繁殖快的菌種（代時(shí)6h），接種量不低于10%。4.3.2培養(yǎng)溫度發(fā)酵溫度應(yīng)控制在2535，對(duì)特殊類型的菌種應(yīng)根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過(guò)程中，可根據(jù)菌體的生長(zhǎng)代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。4.3.3供氧通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補(bǔ)充無(wú)菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。對(duì)于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界

9、氧濃度；嚴(yán)格厭氧類型菌株培養(yǎng)基的氧化還原電位不得高于其臨界氧化還原電位。4.3.4物料含水量固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為50%60%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，應(yīng)控制在20%40%。4.3.5發(fā)酵終點(diǎn)判斷下列參數(shù)為發(fā)酵終點(diǎn)判定依據(jù)： 鏡檢觀察菌體的形態(tài)、密度,要求芽胞菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)芽胞形成率80%； 監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中還原糖、總糖、氨基氮、pH值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)； 監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中攝氧率、CO2產(chǎn)生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)； 固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。4.4后處理后處理過(guò)程可分為發(fā)酵物同載體（或物料）混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類型。4.4.1發(fā)酵物同載

10、體(或物料)混合吸附對(duì)載體及物料的要求如下： 載體的雜菌數(shù)1.0104個(gè)/ g； 細(xì)度、有毒有害元素（Hg、Pb、Cd、Cr、As）含量、pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲(chóng)卵死亡率值達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求； 有利于菌體（或芽胞、孢子）的存活。發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護(hù)劑或采取適當(dāng)措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應(yīng)注意無(wú)菌控制,避免雜菌污染。4.4.2發(fā)酵物直接分裝對(duì)于發(fā)酵物直接分裝的產(chǎn)品劑型，可根據(jù)產(chǎn)品要求進(jìn)行包裝。4.5建立生產(chǎn)檔案每批產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)存檔記錄，包括檢驗(yàn)項(xiàng)目、檢驗(yàn)結(jié)果、檢驗(yàn)人、批準(zhǔn)人、檢驗(yàn)日期等信息。4.6產(chǎn)品質(zhì)量跟蹤定期檢查產(chǎn)品質(zhì)量，并對(duì)產(chǎn)品建立應(yīng)用檔案，跟蹤產(chǎn)品的應(yīng)用情況。 附錄A （資料性附錄）農(nóng)用微生物制劑生產(chǎn)工藝流程示意圖（略） 附 錄 B （資料性附錄） 農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中菌種的常用保藏方式保藏方式一般存放條件適合的微生物菌種類型一般保存期限凍干管保藏冰箱或室溫各類菌種5年以上沙土管保藏干燥條件芽胞桿菌、真菌、放線菌2年以上石蠟油保藏4冰箱各類菌種1年以上甘油管保藏-18冰箱或更低溫度主要是細(xì)菌1年以上固體曲保藏干燥條件,4冰箱產(chǎn)生各類孢子的真菌1年以上常規(guī)保藏4左右冰箱各類菌種2個(gè)月12個(gè)月 附 錄 C （資料性附錄） 農(nóng)用微生物制劑的生產(chǎn)中常用滅菌方法及適用對(duì)象滅菌方式操作要求一般應(yīng)用對(duì)象高壓蒸汽滅菌1151